• 400电话

    400-6345-876

  • 固定电话

    027-87388389

  • 移动电话

    18995514293 18971188977

  • 传    真

    027-87388389

  • 地    址

    武汉市洪山区狮子山街张吴村华大家园(华师教师还建住宅小区)A4栋1单元602室

  •   合肥分公司

  • 合肥电话

    0551-63646173

  • 移动电话

    18963781346

  • 合肥地址:

    合肥市蜀山区槽郢路微商学院14号4栋2单元203室

RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒…

产品编号: CC9716

产品包装: 20T/50T

产品价格: 390元/650元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒

适用范围:
适用于快速提取各种动植物细胞/组织高纯度总RNA

 
试剂盒组成、储存、稳定性:﹢

试剂盒组成
保存
20次
50次
裂解液RL
4℃避光
25ml
50ml
去蛋白液RE 
室温
15ml
25ml
漂洗液RW
室温
5ml
10ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10ml
10ml
70%乙醇
室温
4ml RNase-free H2O
9ml RNase-free H2O
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free吸附柱RA
室温
20个
50个
收集管(2ml)
室温
20个
50个

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
 1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。裂解液 RL 可以常温运输,收到后4℃避光保存。
 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:改进的异硫氰酸胍/酚一步法裂解细胞和灭活RNA酶,然后总RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好,纯度高和离心柱方便快捷的优点,不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程,RNA 可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。
3. 独有的 RL 裂解液配方,可以有效的消除基因组污染。
4. 多次漂洗去蛋白过程,提取 RNA 纯度更高。
5. 有效的去除了 5S 在总 RNA 中含量,提高了纯度。
 
注意事项:
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2. 为防止RNA降解,所有离心步骤如未加说明,均在4℃低温进行。使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf5415C或者类似离心机。
3. 裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗
4. 考虑到环保问题,本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿,用户使用前需要自备氯仿。
5. 常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带,分别为~5Kb(28S),~2Kb(18S),条带亮度比值约为2:1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S,tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4,5条带也属于正常现象,如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的不连续的高分子量条带。
6. 检测OD260/OD280吸光度比值时,RNA样品应该溶于TE后检测,如果用水稀释后检测,由于一般水离子强度和PH值低,会使OD280升高,从而使比值降低。
7. 加入裂解液RL匀浆后,加氯仿前,样品可在–60℃-70℃保存一个月以上。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇!
1. 匀浆处理
a. 组织
用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品,保存于液氮内样品需要用研钵磨碎,每50~100mg组织加1ml的裂解液RL后匀浆。组织样品容积不能超过RL容积的10%。
b. 单层生长的细胞
直接往直径3.5cm的培养板中加入1ml的RL溶解细胞,并用移液枪轻轻吹打混匀。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的RL量(每10cm2加1ml)。一般情况下,普通大小的细胞培养瓶,加入1ml的RL,  迅速轻摇使RL充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶,轻轻用移液枪反复吹打混匀。当RL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。
c. 悬浮生长的细胞
通过离心来沉淀细胞。在RL试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加1ml的RL。在加入RL前应避免洗涤细胞,否则会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。
 
2. 将匀浆样品剧烈震荡混匀,在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
 
3. 可选步骤:4℃的条件下12,000rpm离心10分钟,小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。当样品富含蛋白质、脂肪、多糖或是细胞外物质例如肌肉。脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8℃的条件下以12,000rpm离心10分钟,移除匀浆中不溶解的物质,余下的沉淀中包含有细胞外膜、多糖、以及高分子量DNA,而上层的超浮游物含有RNA。
 
4. 每1mlRL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
 
5. 于4℃ 12,000rpm离心10分钟,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%,把水相转移到新管中,进行下一步操作。
 
6. 加入等体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
 
7. 12,000rpm离心45秒,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。
 
8. 加500ul去蛋白液RE,12,000rpm离心45秒,弃掉废液。
 
9. 加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心45秒,弃掉废液。
 
10. 加入500μl漂洗液RW,12,000rpm离心45秒,弃掉废液。
 
11. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
12. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80ul RNase free water(事先在65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟, 12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟,或者另外再加30ul RNase free water,离心1分钟,合并两次洗脱液。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要RNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积最好不少于30ul,体积过小降低RNA洗脱效率,减少RNA产量。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
 
 
 
 
RNA 产量低
* 样品裂解或者匀浆不彻底--建议:液氮研磨的时候尽量研磨完全,加入裂解液 RL 后剧烈震荡或者用枪头吹打帮助裂解。匀浆步骤可以提高产量。新鲜组织或者植物组织可以不需液氮,SK在干净研钵内加入适量裂解液 RL 直接研磨。
* 使用的样品或者裂解物在-20℃或者-70℃存放太久--建议:存放时间过长可能降低 RNA 产量,应尽快的处理样品或者裂解物
* 组织本身含 RNA 少--建议:不同类型的组织和细胞含有不同量的RNA,对于含量少的组织应该适当提高起始处理量。
* 超过了吸附柱的最大吸附能力--建议:同一个样品使用多个吸附柱,然后合并得到 RNA。
* 去蛋白液RE和漂洗液RW内忘记加乙醇--建议:第一次实验时,漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇。
 
OD260/OD280
吸光度比值<1.6
* 分光光度计检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下,OD280值会较高,造成比值低。--建议:检测时用TE稀释样品
* 污染了蛋白或者苯酚--建议:做步骤5吸取取上清水相的时候小心不要吸取到中间相和下层有机相,确保做了步骤8。
下游的RT-PCR
实验不成功
* 忘记做步骤11,或者将吸附柱取出时下端碰到了收集管里面的漂洗液,造成洗脱下来的RNA含有乙醇,乙醇抑制了逆转录反应-建议:确保做了步骤11,然后小心取出吸附柱,可以在空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
 
基因组DNA污染
* 起始样品量超出了裂解液RL的处理范围--建议:选择合适的起始处理量。
* 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液。--建议:避免这些可以改裂解液 RL 性质或者PH值的物质。
* 吸取上清时吸入了中间相--建议:做步骤5吸取取上清水相的时候小心不要吸取到中间相。
 
 
RNA降解,
完整性不佳
* RNA 提取所用各种物品和试剂没有灭活 RNA 酶-建议:按照注意事项准备 RNA 提取的各种用品。
* 组织取出后没有马上处理或冷冻,提取前已经降解-建议:组织应该尽量立刻处理,不能及时处理的应该尽快保存于液氮或者-70℃。
* 提取的RNA样品没有保存在-20℃或-70℃低温--建议:尽可能的将 RNA 保存在-70℃的低温。
* 样品提取过程中降解-建议:提取动作应该尽可能的快,离心应该低温进行,取用 RNA 时尽量冰上进行。