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EASYspin全血RNA快速提取试剂盒C…

产品编号: CC9718

产品包装: 20T/50T

产品价格: 490元/980元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于快速提取全血总RNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
20
50
10×红细胞裂解液RLB
室温
10 ml
25 ml
裂解液RLT
室温
20 ml
50 ml
去蛋白液RW1
室温
15 ml
40 ml
漂洗液RW
 
室温
5 ml
10 ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10 ml
10 ml
70%乙醇
室温
4ml RNase-free H2O
9ml RNase-free H2O
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free吸附柱RA和收集管
室温
20 套
50 套

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:红细胞裂解液选择性裂解红细胞,然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 反复优化的红细胞裂解液配方,裂解效果快速完全。
4. 快速,简捷,单个样品操作一般可在40分钟内完成。
5. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RT-PCR,Northern-
blot和各种实验。
 
注意事项:
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!

2. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

3. 需要自备乙醇,β-巯基乙醇,一次性注射器,研钵。

4. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5. 预防RNase污染,应注意以下几方面:
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2) 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)

6. 关于DNA 的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大,如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。

7. RNA纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris, PH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的PH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,PH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
²        第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
²        使用前将10×红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1×。
²        操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如1ml RLT中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。
 
1. 在适合大小的RNase free离心管中加入1体积(<1.5ml)加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀。
 
2. 室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞)。
如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。
 
3. 12,000rpm离心20秒,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2,3。
上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低。
 
4. 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬,加入350μl(<0.5ml全血)或者600μl(0.5-1.5ml全血)裂解液RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充分裂解。
病人血样中白细胞数量可能大幅增加,应该适当减少处理量。或者按照350μl(<2×106白细胞)或者600μl(2×106-1×107白细胞)比例加RTL。
 
5. 用带钝针头的一次性1ml(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物5-10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
 
6.较精确估计裂解物体积,加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
 
7. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒,弃掉废液。
 
8. 加700μl去蛋白液RW1,室温放置30秒,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
 
9. 加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
 
10. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
11.    取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water(事先在70-80℃水浴中加热效果更好),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
 
12. 如果提取全血>0.5ml或者>2×106白细胞,加30-50μl RNase free water重复步骤11,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍 (如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。