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ESAYspin Plus组织/细胞RNA快速提…

产品编号: CC9720

产品包装: 20T/50T

产品价格: 600元/1200元

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  • 产品简介
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ESAYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒
 产品编号:CC9720

包装单位:20次、50次
适用范围:适用于快速提取动物细胞和易裂解动物组织总RNA,使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,不需要使用DNase消化,RNA可直接用于PCR,荧光定量PCR。
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
20
50
裂解液RLTPlus
室温
20ml
50ml
去蛋白液RW1
室温
15ml
40ml
漂洗液RW
室温
5ml
10ml
 
 
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10ml
10ml
70%乙醇
室温
4ml RNase-free H2O
9ml RNase-free H2O
 
 
第一次使用前按说明加指定量乙醇
基因组DNA清除柱和收集管
室温
20套
50套
RNase-free吸附柱RA和收集管
室温
20套
50套

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在 37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本公司独家推出EASYspin无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上,又独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA 酶,然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱,基因组DNA被清除而 RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 完全不使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速,简捷,单个样品操作一般可在 30 分钟内完成。
3. 独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除gDNA残留,得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于 RT-PCR,Northern-blot和各种实验。
 
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力,否则造成DNA残留或者产量降低。          不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大,例如胸腺脾脏DNA含量丰富,超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细RNA含量丰富,超过3×106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时如果不清楚样品DNA/RNADNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如细胞不超过3-4×106,组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3.裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗
4. 预防RNase污染,应注意以下几方面:
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2) 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA在裂解液RLT Plus中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)
5. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留),本公司的EASYspin Plus RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术,绝大多数DNA已经被清除,不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量 PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
6. RNA 纯度及浓度检测:
完整性: RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18SrRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris,PH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的PH值影响。同一个RNA样品,假定在 10mM Tris,pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260, OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/ul)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)

提示:第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
1. 组织培养细胞
a. 收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管,对于贴壁细胞,孔板培养可以直接裂解,细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b. 13,000rpm离心10秒(或者300g离心5分钟),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬, 加 350ul(<5x106细胞)或600ul(5×106-1×107细胞)裂解液RLT Plus,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。
d. 匀浆:(处理细胞量极少时<1x105一般不需要,涡旋振荡一分钟匀浆)。用带钝针头的一次性1 ml(配0.9mm 针头)注射器剧烈抽打裂解物10次以上或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
e. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
f. 立刻接操作步骤项下3。
2. 动物组织(例如鼠肝脑)
a. 电动匀浆:新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350ul(<20mg 组织)或者600ul(20-30mg组织)的裂解液RLT Plus后电动彻底匀浆20-40秒。
b. 液氮研磨++匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉 (20mg/30mg)转入装有350ul/600ul组织裂解液RLT Plus的1.5ml离心管中, 用手剧烈振荡20秒,充分裂解。用带钝针头的一次性1 ml(配0.9mm针头)注射器剧烈抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
c. 将匀浆后裂解物13,000rpm离心3分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物,将裂解物上清全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
d. 立刻接操作步骤项下3。
3. 立刻 13,000rpm离心60秒,保留滤过液(RNA在滤过液中)。确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。
4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为350ul/600ul,滤过时候损失体积应该减去),加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
5. 立刻将混合物(每次小于700ul,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000         rpm离心30秒,弃掉废液。
6. 加700ul去蛋白液RW1,室温放置1分钟,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
7. 加入500ul漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500ul漂洗液RW,重复一遍。
8. 将吸附柱 RA 放回空收集管中, 13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50ul RNase free water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
10. 如果预期RNA产量>30ug,加30-50ul RNase free water重复步骤9,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,,用户根据需要选择。