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EASYspin细菌RNA快速提取试剂盒 …

产品编号: CC9724

产品包装: 20T/50T

产品价格: 480元/920元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于快速提取细菌总RNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
20
50
TE(PH8.0)
室温
6 ml
6 ml
溶菌酶
4℃
20 mg
20 mg
裂解液RLT
室温
20 ml
50 ml
去蛋白液RW1
室温
15 ml
40 ml
漂洗液RW
室温
5 ml
10 ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10ml
10ml
RNase-free吸附柱RA和收集管
室温
20 套
50 套

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RT-PCR,Northern-
blot和各种实验。
 
注意事项:
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
3. 需要自备乙醇。
4. 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 预防RNase污染,应注意以下几方面:
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2) 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)
6. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的 DNA 残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大,如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
7. RNA纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris,PH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的PH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,PH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/ul)=(OD260)×(稀释倍数n)×40。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
²        第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!
²        提取细菌 RNA 需先配制加了溶菌酶或者lysostaphin的TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA),TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin,浓度为1mg/ml。
 
1. 离心收集1-2ml菌液(108-109细胞)到一个1.5ml 离心管,尽可能去除上清,注意残留的上清不能超过20ul/每使用100ul TE(见下面步骤2)。
 
2. 根据细胞的种类和数量,充分重悬细胞在100ul(5×108细胞)/200ul(5×108-7.5×108细胞)TE中(10 mM Tris-
HCl,1mM EDTA),TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin,浓度为1mg/ml,或者直接用TE重悬后,用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。
 
3. 室温(15-25℃)温育5分钟/溶菌酶,或者37℃温育15分钟/lysostaphin,破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。
注意各种细菌破壁的难易程度不一样,一般革兰氏阴性菌使用上面的条件就足够了,甚至可能省略该步骤,但是某些阳性难破壁需要提高溶菌酶浓度或者使用lysostaphin,玻璃珠机械破壁,蛋白酶K消化或者联合使用等方法,需要根据用户自己的具体情况调节酶的工作浓度和温育温度、时间和选择正确的方法。
 
4. 加入350ul(如果上面使用100ul TE/酶)或者700ul(如果上面使用200ul TE/酶)裂解液RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充分裂解。
一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm离心3分钟,,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物,将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
 
5. 加入250ul 96-100%乙醇(曾加入100ul TE/350ul RLT管)或者500ul 96-100%乙醇(曾加入200ul TE/700ul RLT管),立即吹打混匀。
一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒,弃掉废液。
 
7. 加700ul去蛋白液RW1,室温放置30秒,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
 
8. 加入500ul漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500ul漂洗液RW,重复一遍。
 
9. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
10. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50ul RNase free water(事先在70-90℃水浴中加热效果更好),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
 
11. 如果预期RNA产量>30ug,加30-50ul RNase free water重复步骤10,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。