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EASYspin酵母RNA快速提取试剂盒,…

产品编号: CC9728

产品包装: 50T

产品价格: 1100元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
缓冲液SE
室温
30 ml
Lyticase 10U/ul
室温
2500U
裂解液RLT
室温
20 ml
去蛋白液RW1
室温
40 ml
漂洗液RW
室温
10 ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10 ml
RNase-free吸附柱RA和收集管
室温
50 套

本试剂盒按照指示储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 为避免降低活性,方便运输,提供Lyticase(2500U)为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入0.25毫升灭菌水溶解配制成10U/ul,因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存,-20℃保存。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:酵母细胞经 lyticase 处理去除细胞壁后,独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20 将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速,简捷,单个样品操作一般可在20分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RT-PCR,Northern-blot和各种实验。
 
注意事项:
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm 的传统台式离心机。
3. 需要自备乙醇,β-巯基乙醇,水浴锅。
4. 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 关于DNA的微量残留:
一般情况下,一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大,如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4)   在步骤去蛋白液 RW1 漂洗前,直接在吸附柱 RA 上进行 DNase                        I 处理。请联系我们索取具体操作说明书。
6. RNA纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris,PH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的PH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,PH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/ul)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
 

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
²        第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶中加入指定量无水乙醇!
²        操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如1ml RLT中加入10ul β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。
²        吸取使用量的缓冲液SE加入0.1%β-巯基乙醇备用。
 
1. 小量酵母培养细胞
a. 收集1ml(约107细胞)处于对数生长期酵母培养物到1.5ml离心管,12,000rpm离心30秒,尽可能吸弃上清。
 b. 加入 100ul 缓冲液 SE 中(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.1%),轻柔吹打充分重悬细胞;根据酵母量加入约50U lyticase,充分颠倒混匀,37℃温育15-30分钟消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致RNA产量低,可以加大lyicase用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间来提高效果,不适合Lyticase消化的酵母可选用Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋,反复冻融等。
c. 加入350ul裂解液RLT(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%),吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充分裂解。
一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm离心3分钟,,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物,将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。       
d. 加入250ul 96-100%乙醇,立即吹打混匀,不要离心。
e. 接操作步骤项下3。
 
2. 中量酵母培养细胞
a. 收集2-3ml(约3×107细胞)处于对数生长期酵母培养物到1.5ml离心管(超过1.5ml可分两次在同一个离心管内进行收集细胞),12,000rpm离心30秒,尽可能吸弃上清。
b. 加入600ul缓冲液SE中(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.1%),轻柔吹打充分重悬细胞;根据酵母量加入约 100-150U lyticase,充分颠倒混匀,37℃温育15-30分钟消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致RNA产量低,可以加大lyicase用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间来提高效果,不适合Lyticase消化的酵母可选用sZymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋,反复冻融等。
c. 13,000rpm离心1分钟,尽可能吸弃上清。
d. 加入350ul裂解液RLT(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%),吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充分裂解。
一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm离心3分钟,,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物,将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
e. 加入等体积70%乙醇(DEPC水配制,约350ul)立即吹打混匀,不要离心。
f. 接操作步骤项下3。
 
3. 将混合物加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,弃掉废液。
 
4. 加700ul去蛋白液RW1,室温放置30秒,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
 
5. 加入500ul漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500ul漂洗液RW,重复一遍。
 
6. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
7. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50ul RNase free water(事先在70-80℃水浴中加热),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
 
8. 如果预期RNA产量>30ug,加 30-50ul RNase free water重复步骤7,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的 RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。