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一步法荧光定量耐热反转录PCR试剂…

产品编号: CC31601 / CC31602

产品包装: 50次/100次

产品价格: 1500元/2700元

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一步法荧光定量耐热反转录PCR试剂盒(THERMOscript One Step qRT-PCR Kit)



产品组成、储存、浓度:
储       存:
-20℃ 保存,有效期 12 个月。
制品说明:本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂,用本制品进行Real Time qRT-PCR可在同一反应管内连续进行。反应过程中无需打开管盖添加试剂并可对扩增产物进行实时检测,避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。非常适合于微量RNA尤其是微量RNA病毒的检测。本试剂盒包括最适合Real Time PCR的突变改造M-MuLV H Minus逆转录酶(THERMOscript RTase)、热启动 HotMaster Taq DNA 聚合酶和RNasin抑制剂mix、同时包含适用于逆转录和 PCR 扩增的优化独特反应体系。 本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的 RNase H 活性缺失,与M-MuLV 相比,具有更强的延伸能力和稳定性。同时该酶多点突变提高了耐热性,可以在50℃反转录,提高了复杂二级结构, 含量丰富模板反转录效率。GC而采用优质热启动酶 HotMaster Taq DNA Polymerase 可以最大限度的减少 PCR 扩增全程中的非特异性扩增产物产生,大大提高了荧光定量 PCR 反应的精确性。本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因进行准确定量检测,重复性好,可信度高。
适用范围:适用于高拷贝、低拷贝基因检测;部分高 GC 含量或具有复杂二级结构的 RNA 模板。

注意事项:
l 当同时需要进行数次Real Time One Step qRT-PCR反应时,应先配制各种试剂的混合液(Master Mix,其中包括RNase-free ddH2O、Buffer、各种酶等),然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确,减少试剂损失,避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
l 使用Enzyme Mix和TRUEscript RTase时,分取之前要小心地瞬间离心收集到反应管底部;由于酶保存液中含有高浓度的甘油,粘度高,分取时应慢慢吸取。
l 2×qRT-PCR Mix内含Sybr Green I,保存或配制One Step qRT-PCR反应液时应避免强光照射。
本制品不含Rox Reference Dye,部分需要用Rox染料校准孔间差异的荧光定量PCR仪器可另外选购Rox Reference Dye(货号:CC318),说明书可以找我们索取或者登录
www.chuchengkj.com查看。
l 为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板。
l 不同的片段,所需最佳RNA模板用量不同,过多的RNA会抑制反应,建议根据反应调整模板用量。
l 只能使用特异性引物,不能使用 Oligo(dT) 和 Random Primer 进行反应。

反应体系(以 20ul/50ul 举例):
注意:2×qRT-PCR Mix使用前充分融解颠倒混匀(避免剧烈涡旋产生大量气泡)短期频繁使用可放4℃冰箱。



注意:引物浓度请以终浓度 0.2-0.6μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。如果同进行多个反应,先按比例配成混合液,振荡混匀后,按每管50-Xul(X为模板量)分装。

Real Time PCR 扩增:
1. 将配制好的反应体系混匀、离心后。
2. 将 PCR 仪器预热到 50℃,将 PCR 管置于荧光定量 PCR 热循环仪中,按以下反应条件进行反应。

扩增程序:

注意:如果所采用的荧光定量PCR仪器没有特殊的要求,建议采用上述图表显示的标准的三步法PCR反应
程序,如果使用该程序得不到良好的实验结果时,再进行 PCR 条件的优化,例如采用两步法进行扩增可以减
少非特异扩增,增强扩增的特异性。
3. 实验结果分析。反应结束后确认One Step qRT-PCR的扩增曲线和融解曲线,进行RT-PCR定量时制作标准
曲线等。