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miRNA第一链合成试剂盒 CC53401

产品编号: CC53401

产品包装: 25次

产品价格: 1900元

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miRNA第一链合成试剂盒

组成 
CC53401
E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μl)
50U
10×Poly(A) Polymerase Buffer
100μl
10×rATP solution
50μl
25μmol RT primer
50μl
TUREscript Hˉ RTase (200U/μl)
5000U
5×RT Buffer
250μl
dNTP Mixture(10mM each)
25μl
RNase free H2O
1ml










产品组成、储存:
-20℃保存。
 
制品说明:miRNA 第一链合成试剂盒本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾 Poly(A),再使用Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆转录引物进行逆转录反应,最终生成miRNA对应的cDNA第一链。miRNA cDNA第一链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)修饰过程和逆转录过程的所有试剂,该试剂盒具有高效的Poly(A)  修饰和逆转录效率,可从20pg-2μg的total RNA中有效制备miRNA对应的cDNA第一链。一次合成的cDNA可检测多个microRNA,节约了样品和成本。
 
注:该试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒(CC53501)配套使用。

 

 操作步骤:
 一、miRNA3’末端进行加Poly (A)处理
 1. 在冰上预冷RNase free的反应管内加入以下试剂至总体积20μl (最后加入E.coli Poly(A) Polymerase)

Components
Volumn
Final Concentration
Total RNA
xμl
Up to 2μg
E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μl)
0.4μl
2U
10×Poly(A) Polymerase Buffer
2μl
1 X
10×rATP solution
2μl
1 X
RNase free H2O to final volume
20μl
 

*在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。
*此过程也可以使用小分子RNA(建议加入量为2μl~4μl。请根据目的miRNA丰度决定加入量)。
 2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后在37℃反应30-60min。所得的Poly(A)反应液可以立即进行
 第一链合成,也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。
 
二、加Poly (A)修饰后的miRNA进行逆转录反应(第一链合成)
1. 按照下表组分冰上进行反应液的配制
Components
Volume
上述Poly(A)反应液
2-4μl
25μmol RT primer
2μl
5×RT Buffer
4μl
dNTP Mixture(10mM each)
1μl
TUREscript Hˉ RTase (200U/μl)
0.9μl
RNase free H2O to final volume
20μl
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后在42℃反应50min。
3. 70℃加热15min失活TUREscript Hˉ RTase。合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存;也可以直接进行下游
PCR或者荧光定量PCR检测。
 
注:按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时,可以根据实际情况选择使用量,如果发现有非特异扩增条带,或者融链曲线显示有非特异扩增,往往提示cDNA模板过量,可以将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。