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KOD DNA Polymerase  CC51101  C…

产品编号: CC51101 / CC51102

产品包装: 250 U/500 U

产品价格: 350元/650元

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  • 产品简介
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Components
CC51101
CC51102
KOD DNA Polymerase
250U
500U
10×KOD Buffer
1ml
1ml

 
 
 
 
产品储存: 20℃保存
 
制品说明:KOD DNA Polymerase是从克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强3’→ 5’外切酶活性使得其扩增保真性比Pfu DNA Polymerase更高,保真性是Taq的约50 倍,同时具有合成速度快的特点,聚合速度约为普通Pfu DNA Polymerase的5倍,Taq DNA Polymerase的2倍,达到100-138bp/秒,可以在短时间内获得高产量的扩增产物,特别适合于高保真地扩增6kb以内的PCR产物,扩增所得的DNA为平末端,可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。
 
活性定义:75℃活性测定条件下,在30min内摄入10nmoles的dNTPs使成为酸性不溶物时所需要酶的活性定义为1U。
 
用途:PCR,尤其用于PCR产物的克隆,DNA片段的平滑化。

 

建议PCR条件(以50μl反应体系为例)

Components
Volume
Final Concentration
Template
Variable
<0.5μg
Forward Primer 10μM
1μl
0.2μM
Reverse Primer 10μM
1μl
0.2μM
10×KOD Buffer
5μl 
DNTP Mixture(10mM each)
1μl
0.2mM
KOD DNA Polymerase
0.25-0.5μl(1.25-2.5U)
dH2O
Up to 50μl
 

用无菌PCR级别的水补至终体积50μl。实际操作中计算好需补加水的量后,建议先加水,然后按上述顺序添加其它成分,最后添加KOD DNA Polymerase。充分混匀后,离心数秒使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。
注意:在冰浴上混合PCR各种成分,防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。
 
PCR条件的优化
1. 质粒或者噬菌体模板:
模板量5-20ng,循环参数如下表

Cycling parameters
<1kbp target DNA
1-2kbp target DNA
3-4kbp target DNA
5-6kbp target DNA
Step 1
94℃ 2 min
94℃ 2 min
94℃ 2 min
94℃ 2 min
Step 2
94℃ 20 sec
94℃ 20 sec
94℃ 20 sec
94℃ 20 sec
Step 3
Ta 20 sec
Ta 20 sec
Ta 20 sec
Ta 30 sec
Step 4
72℃ 20 sec
72℃ 30 sec
72℃ 40 sec
72℃ 60 sec
Step 5
72℃ 5 min
72℃ 5 min
72℃ 5 min
72℃ 5 min
Repeat step 2-4 for 30-35cycles
Ta=Tm 5℃

 
2. 基因组DNA和cDNA模板:
基因组DNA模板量为50-100ng,1-2μl cDNA(起始转录用的RNA为500ng),循环参数如下表

Cycling parameters
<2kbp target DNA
Step 1
94℃ 2 min
Step 2
94℃ 20 sec
Step 3
Ta 20 sec
Step 4
72℃ 20 sec
Step 5
72℃ 5 min
Repeat step 2-4 for 30-35cycles
Ta=Tm 5℃

 
问题与解决方法:

问题
可能的原因
解决方法
没有PCR产物
 
 

设计的扩增靶序列太长
设计稍短的扩增靶序列,以基因组DNA为模板KOD适合扩增不超过2kb左右的产物,以质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增6kb以下的DNA。
PCR条带弥散
没有在冰上混合PCR反应液KOD扩增延伸速度为1Kb/30 秒,具有比其它聚合酶更快的延伸速度延伸时间过长,有时会有拖尾弥散效应。
PCR反应液应该在冰上混合,KOD DNA聚合酶应该最后加,以防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。如出现拖尾效应,可缩短退火延伸时间或者减少酶量。
低产量
模板为高GC含量
模板量太低
加入DMSO2-5%,由于该酶的耐热性好,在应用于GC含量高的模板等以及易产生高级结构的模板时,可在96℃以上进行变性。提高模板量