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一步法耐热反转录PCR试剂盒THERM…

产品编号: CC53301 / CC53302

产品包装: 25次 / 50次

产品价格: 1500元/2700元

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一步法耐热反转录PCR试剂盒THERMOscript One Step RT-PCR Kit

组成
CC53301
CC53302
2×RT-PCR Mix
625μl
1250μl
Enzyme Mix
(Contains HotMaster DNA Polymerase and RNasin)
 
 

25μl     

50μl
THERMOscript RTase
25μl     
50μl
RNase free H2O
1.5ml
 1.5ml
 








储存:
-20℃保存,有效期 6 个月。
 
制品说明:本试剂盒是专为一步法 RT-PCR 实验配制的,使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录反应和PCR扩增反应。反应过程中无需打开管盖添加试剂,避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括多点突变改造耐热M-MuLV H Minus逆转录酶、热启动HotMaster Taq DNA 聚合酶和RNasin抑制剂 mix、同时包含适用于逆转录和 PCR 扩增的优化独特反应体系。本酶M-MuLV(RNaseHˉ)的RNase H 活性缺失,与 M-MuLV相比,具有更强的延伸能力和稳定性,可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。同时该酶可以在高达50-60℃反转录,大大提高了复杂二级结构,GC含量丰富模板反转录效率,产量敏感度和特异性比一般试剂盒显著特高。
 
适用范围:适用于高拷贝、低拷贝基因检测;适用于高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。
 
建议反应体系(50μl):
注意:2×RT-PCRBuffer低温时可能有结晶析出,应手心加热或者涡旋振荡恢复融解后使用。短期使用可放4℃冰箱。
根据下表冰上配制反应液:

Components
Volumn
Final Concentration
2×RT-PCR Buffer
25μl
1×_
Forward Primer(10μm)
1μl
0.2μM
Reverse Primer(10μm)
1μl
0.2μM
Enzyme Mix
1μl
THERMOscript RTase
1μl
RNA template
Xμl
1pg-2μg-
RNase free H2O
To X μl
Not applicable -

注意:引物浓度请以终浓度0.2-0.6μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。如果同进行多个反应,先按比例配成混合液,振荡混匀后,按每管50-Xμl(X为模板量)分装。

 

PCR扩增:
1. 将配制好的反应体系混匀、离心后。
2. 将热循环仪预热到50-55℃,将PCR管置于热循环仪中,按一下反应条件进行反应。
扩增程序:

 
温度
时间
循环数
1
50-55℃
30分钟
1
2
94℃
2-5分钟
1
 
3
94℃
30秒
 
30-40
50-60℃
30秒
72℃
1-2kb/分钟
4
72℃
5-10分钟
1
5
4℃
保温

注意:可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少,扩增量不足;循环次数多,错配机率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。
 
注意事项:
●避免RNase污染。
●为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板
●不同的片段,所需最佳RNA模板用量不同,过多的RNA会抑制反应,建议根据反应调整模板用量。
●不能使用Oligo(dT)和Random Primer合成cDNA。