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EASYspin Plus 大量组织/细胞RNA…

产品编号: CC9749

产品包装: 10次

产品价格: 2600元

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 产品编号:CC9749

 包装单位:10次
 
适用范围:适用于快速提取动物细胞和易裂解动物组织总RNA,使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,不需要使用DNase消化,RNA可直接用于PCR,荧光定量PCR.。
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
10
裂解液RLTPlus
室温
100ml
去蛋白液RW1
室温
120ml
漂洗液RW
室温
25ml×2
第一次使用前按说明加指定量乙醇
70%乙醇
室温
15ml×2
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10ml
基因组DNA清除柱和收集管
室温
10套
RNase-free吸附柱RA和收集管
室温
10套

本试剂盒在室温储存 6 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在 37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本公司独家推出EASYspin无苯酚、氯仿 RNA 快速提取技术基础上,又独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除gDNA残留,得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱,基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速,简捷,单个样品操作一般可在60分钟内完成。
3. 独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除gDNA残留,得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RT-PCR,Northern-blot和各种实验。

注意事项:
1. 所有的离心步骤均可在室温完成,使用可容纳50ml离心管的离心机。
2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和RNA吸附柱RA处理能力,否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大,例如胸腺脾脏DNA含量丰富,超过100mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富,超过6×107细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时,如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如细胞不超过6×107,组织不超过200mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3. 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗
4. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数 RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA 表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
5. RNA 纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中 70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5 kb 和2kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物 RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris,pH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行 OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
1. 组织培养细胞
a. 收集<2×108悬浮细胞到一个合适大小离心管,对于贴壁细胞,孔板培养可以直接裂解,细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b. 10,000-13,000xg离心20秒(或者300g 离心5分钟),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬,加 5ml(<108细胞)或 10ml(1×108-2×108细胞)裂解液RLT Plus,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。
d. 匀浆:(处理细胞量极少时<2×106一般不需要,涡旋振荡一分钟匀浆)。用带钝针头的一次性10ml(配0.9mm 针头)注射器剧烈抽打裂解物10次以上或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆60秒),可以剪切DNA,降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
e. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
f. 立刻接操作步骤项下3。
 
2. 动物组织(例如鼠肝脑)
a. 电动匀浆:新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入 5ml(<250mg 组织)或者10ml(400-500mg组织)的裂解液RLT Plus后电动彻底匀浆1分钟。
b. 液氮研磨+匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(250mg/500mg)转入装有5ml/10ml组织裂解液RLT Plus的50ml离心管中,用手剧烈振荡 20 秒,充分裂解。用带钝针头的一次性10 ml(配0.9mm针头)注射器剧烈抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆60秒),可以剪切DNA,降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
c. 将匀浆后裂解物10,000-13,000xg离心5钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物,将裂解物上清全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
d. 立刻接操作步骤项下3。
 
3. 立刻10,000-13,000xg离心5分钟,保留滤过液(RNA在滤过液中)。
确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。
 
4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为5ml/10ml,滤过时候损失体积应该减去),加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
 
5. 将混合物加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)10,000-13,000xg离心3分钟(确保全部通过,膜上无残留液体,否则应加大转速和时间),弃掉废液。
 
6. 加10ml去蛋白液RW1,室温放置1分钟,12,000xg离心3分钟,弃掉废液。
 
7. 加入10ml漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),10,000-13,000xg离心1-2分钟,弃掉废液。加入10ml漂洗液 RW,重复一遍。
 
8. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,13,000xg离心5分钟以干燥膜基质残留乙醇,用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇,室温或者烘箱晾干几分钟。
 
9. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加500μl-1ml RNase free H2O,室温放置3分钟,12,000xg离心2分钟。
 
10. 如果预期RNA产量>0.6mg,加300-500μl RNase free H2O重复步骤9,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。