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EASYspin Plus细菌RNA快速提取试…

产品编号: CC9729

产品包装: 20次、50次

产品价格: 600元/1200元

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  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

适用范围:适用于快速提取细菌总RNA,使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,不需要使用DNase消化,RNA可直接用于反转录PCR,荧光定量PCR。

试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
20
50
TE(PH8.0)
室温
6ml
6ml
溶菌酶
4℃
20mg
20mg
裂解液RLT Plus
室温
10ml
25ml
去蛋白液RW1
室温
15ml
40ml
漂洗液RW
室温
5ml
10ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
70%乙醇
室温
4ml RNase-free H2O
9ml RNase-free H2O
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10ml
10ml
基因组DNA清除柱和收集管
室温
20套
50套
吸附柱RA和收集管
室温
20套
50套

本试剂盒在室温储存 6 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本公司推出EASYspin无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上,又独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱,基因组DNA被清除而RNA
穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 完全不使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速,简捷,单个样品操作一般可在 30 分钟内完成。
3. 独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280 典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RT-PCR,Northern-blot和各种实验。
 
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力,否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时,如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3. 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗
4. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留),本公司的EASYspin Plus RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术,绝大多数DNA已经被清除,不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。
个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
5. RNA 纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)
检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为 rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris,pH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA 提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
²        第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
²        提取细菌 RNA 需先配制加了溶菌酶的TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA PH8.0),TE 中已加入溶菌酶,浓度为1mg/ml。
1. 离心收集1-2ml菌液(约108-109细胞)到一个1.5ml 离心管,尽可能去除上清,注意残留的上清不能超过20μl。
2. 根据细胞的种类和数量,充分重悬细胞在100μl(<5×108细胞)/ 200μl(5×108-7.5×108细胞) TE中,TE中已加入溶菌酶,浓度为1mg/ml,或者直接用TE重悬后,用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。
3. 室温(15-25℃)温育5分钟/溶菌酶,破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。
注意各种细菌破壁的难易程度不一样,一般革兰氏阴性菌E.coli使用上面的条件就足够了,甚至可能省略该步骤,但是某些革兰氏阳性菌如B.subtilis难破壁需要提高溶菌酶浓度到15mg/ml和温育时间到10 分钟。如果金黄色葡萄球菌需要加入lysostaphin 到1mg/ml,37℃温育15分钟。总之不同细菌类型破壁难易程度不同,有的难破壁的种类需要根据用户自己的具体情况调节酶的种类、工作浓度和温育温度、时间,此外还可以联合使用玻璃珠击打,机械破壁,蛋白酶K消化等方法帮助破壁。
4. 短暂离心收集细胞到管底,吸弃上清。涡旋振荡重悬分散细胞。
5. 加入500μl裂解液RLT Plus,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充分裂解。
一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm离心33分钟,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物,取裂解物上清进行下一步。
6. 立刻将裂解物加入一个DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)13,000rpm 离心60秒,保留滤过液(RNA在滤过液中)。
确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。
7. 用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为500μl,滤过时候损失体积应该减去),加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
8. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒,弃掉废液。
9. 加700μl去蛋白液RW1,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
10. 加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
11. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
13. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water 重复步骤12,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
14. 洗脱两遍的 RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。