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EASYspin石蜡包埋组织RNA快速提取…

产品编号: CC9744

产品包装: 50次

产品价格: 1500元

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  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
裂解液PKD
室温
15ml
结合液RBC
室温
25ml
漂洗液RW
室温
10ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
蛋白酶K粉(可选)40mg/ml
-20℃
20mg
RNase-free H2O
室温
10ml
基因组DNA清除柱和收集管
室温
50套
RNA吸附柱RA和收集管
室温
50套

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入0.5毫升灭菌水溶解(终浓度40mg/ml)。因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量)分装冻存,-20℃保存。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本试剂盒设计用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取总RNA。独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞释放出RNA,然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱,基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
 
产品特点:
1. 完全不使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速,简捷,单个样品 RNA 提取操作一般可在 1 小时内完成。
3. 试剂盒的独家基因组清除柱和配方确保有效清除基因组DNA残留,一般情况下得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
4. 多次柱漂洗确保 RNA 高纯度,可直接用于下游各种实验。
 
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
 
2. 样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力,否则造成DNA残留或者产量降低。         不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大,例如胸腺脾脏DNA含量丰富,超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富,超过3×106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
 
3. 裂解液PKD、结合液RBC中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
 
4. 预防RNase污染,应注意以下几方面:
1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2)使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3)RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4)配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)
 
5. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留),本公司的EASYspin固定包埋组织RNA快速提取试剂盒,由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术,绝大多数DNA已经被清除,可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量 PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
 
6. RNA纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于RNA与蛋白反应交联会导致RNA断裂或者降解,一般电泳后UV下只能看到模糊弥散(smear)带型,随着储存的时间越长,降解断裂越严重,甚至只能看到峰值仅仅在100bp左右的模糊条带。这都属于RNA提取正常情况。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris,
PH7.5)在 1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的PH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,PH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数 n)×40。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶中加入指定量无水乙醇!
1. 修整去除过量包埋组织外石蜡,并切片成5-20μm厚切片(开始的2-3片抛弃不用)。
 
2. 收集总厚度不超过■40μm的石蜡切片到一个1.5-2ml 离心管(例如2片20μm、4片10μm、8片5μm的石蜡切片),或者不超过▲80μm的石蜡切片到一个2ml离心管。
■代表处理切片总厚度≤40μm,▲代表处理切片总厚度≤80μm
 
3. 加入1ml 100%二甲苯,涡旋振荡10秒。瞬间离心把组织全部浸入到二甲苯。
 
4. 50℃水浴3分钟熔解石蜡,20-25℃最高速离心2分钟,收集组织到管底。
 
5. 小心用移液器吸弃上清二甲苯,注意不要吸到沉淀。
 
6. 加入1ml无水乙醇,涡旋振荡,最高速离心2分钟,小心吸弃上清乙醇。
 
7. 加入1ml无水乙醇,重复步骤6 一遍,尽可能吸弃所有乙醇
 
8. 室温或者37℃晾干乙醇10分钟或直到所有乙醇挥发干。
乙醇完全晾干非常重要,微量的乙醇残留也会导致RNA产量降低。
 
9. 重悬吹打或者涡旋振荡充分重悬组织沉淀在■150μl▲240μl裂解液PKD中,短暂离心收集液体到管底,加10μl蛋白酶K,吹打混匀。
 
10. 55℃孵育15分钟,然后80℃孵育15分钟。
55℃孵育后,可以将离心管取出放置在室温,等水浴锅温度升到80℃后再放入水浴锅,精确的孵育15分钟。即使2分钟的延长也可能导致RNA的部分降解。
 
11. 加入■320μl▲500μl结合液RBC,充分吹打混匀调节结合条件。
 
12.立刻将混合物加入一个基因组 DNA 清除柱中,(清除柱放入收集管中)14,000rpm离心60秒,保留滤过液(RNA在滤过液中)。
应避免吸到可能有的较大的未消化完全的絮团物质上柱子,以免堵塞离心柱。
 
13. 加入■720μl▲1200μl无水乙醇到滤过液中,立即吹打混匀,不要离心。
 
14. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分多次加入)加入一个RNA吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
15. 加入500μl漂洗液 RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
 
16. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
17. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30μl RNase free water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要RNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,如果需要RNA浓度高,可以将洗脱液放回吸附柱RA,再洗脱一遍。