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RNAmisi microRNA快速提取试剂盒…

产品编号: CC9746

产品包装: 50次

产品价格: 1900元

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  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
Lysis/Bindingbuffer
4℃避光
50ml
70%乙醇
室温
9ml RNase-free H2O
第一次使用前按说明加指定量乙醇
Wash Solution 1
室温
12ml
第一次使用前加入28ml无水乙醇
Wash Solution 2/3
室温
10ml
第一次使用前加入42ml无水乙醇
RNase-free H2O
室温
10ml
吸附柱RA和收集管
室温
50套
microRNA吸附柱MA和收集管
室温
50套

本试剂盒按照指示储存 6 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后,可以在常温保存一个月,如果要更长时间保存,请存放在4℃,但是使用前,应该先回复到室温
2. Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体,并不影响使用,直接不吸晶体,吸上清使用就可以。
3. 运输在常温下进行,不影响使用效果。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA(包括siRNA和miRNA)的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收,酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,强烈有机抽提去除蛋白和DNA,RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质进一步去除,最后低盐的洗脱液将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。
3. 快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RNAi,RT-PCR,Northern-blot和各种实验。

注意事项:
1.第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
3. 需要自备乙醇,氯仿,一次性注射器,研钵。
4. Lysis/Binding buffer和Wash Solution 1含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 预防RNase污染,应注意以下几方面:
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2) 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA在裂解液中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)
6. RNA纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mMTris,PH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的PH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM  Tris,PH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA            不纯。
浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

 

操作步骤:(提取包含microRNA的总RNA)
提示:第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇!
 
1. 组织培养细胞
a. 收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管。(对于贴壁细胞,孔板培养和细胞瓶培养可以直接裂解,尽可能吸干净所有培养液残留后直接加入1ml的Lysis/Binding buffer,迅速轻摇使Lysis/Binding buffer充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶,轻轻用移液枪反复吹打混匀接操作步骤项下3。)
b. 13,000rpm离心10秒(或者300g离心5分钟),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬,加入1ml Lysis/Binding buffer,涡旋或者吹打,充分裂解混匀。
d. 接操作步骤项下3。
 
2. 动物组织(例如鼠肝脑)
a. 新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,根据处理组织的质量,按照50-100mg加入1ml的比例加入Lysis/
Binding buffer后电动或者手动彻底匀浆。或者在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(约50-100mg)转入装有1ml Lysis/Binding buffer的1.5ml离心管中,剧烈吹打涡旋混匀。
b. 可选,一般不需要:如果处理量大,有明显颗粒或者不溶物,非常粘稠或者裂解不充分,可立即用带针头的一次性5ml(约0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切     DNA,降低粘稠度和提高产量。
c. 接操作步骤项下3。
 
3. 室温放置5分钟以充分分离核酸蛋白复合物。
 
4. 加入200μl氯仿,剧烈振荡15秒。
 
5. 室温放置2-3分钟,13,000rpm离心10分钟。
 
6. 小心取上清(约600μl)转入到新的离心管,加入1.5倍体积的无水乙醇(必须是室温的,通常900μl),涡旋混匀。此时可能出现沉,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心,立刻接下步。
 
7. 将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30-60秒,弃掉废液。
 
8. 加700μl WashSolution 1(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
9. 加入500μl WashSolution 2/3(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500μl WashSolution 2/3,重复一遍。
 
10. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
11. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water(事先在100℃水浴中预热效果更好),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
 
12. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤11,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
 
附:microRNA富集方法(仅仅提取microRNA,不包含>200nt其它总RNA成份。)
 
1. 按照前面标准操作步骤1-5操作,直到得到上清。
 
2. 较精确估计上清体积(约600μl),加入等体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!)(必须是室温的),涡旋或者吹打充分混匀,不要离心。
 
3. 将混合物加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30-60秒,收集滤过物。将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后,把吸附柱子放回空的收集管内,再加入剩下的混合物,离心,收集滤过物合并两次滤过物,计算体积。
此时,滤过物含有micromicroRNA,吸附柱子上面是除去了micromicroRNA的总RNA(不包含 microRNA),如果需要,可以按照前面标准操作步骤8-11操作漂洗,洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。
 
4. 较精确估计滤过物体积,加入0.65 倍体积无水乙醇(必须是室温的),涡旋或者吹打充分混匀,不要离心。
 
5. 取一套新的microRNA吸附柱MA,将上一步骤混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中,(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
6. 按照前面标准操作步骤8-11操作漂洗,洗脱得到富集的microRNA。
 
注意:不同的实验可以选择不同的方法,例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等,可能减少某些下游试验的扩增背景,当背景较高或者非特异扩增较多时,可以尝试使用富集方法提取的microRNA。