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    合肥市蜀山区槽郢路微商学院14号4栋2单元203室

质粒小量快速提取试剂盒(离心柱…

产品编号: CC9765

产品包装: 50次

产品价格: 140元

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  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 适用范围:适用于小规模质粒制备(mini preparations)

 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50次
100次
200次
RNaseA(10mg/ml)
-20℃
150µl
250µl
500µl
溶液P1
4℃
15ml
25ml
50ml
溶液P2
室温
15ml
25ml
50ml
溶液P3
室温
20ml
35ml
70ml
漂洗液WB
室温
15ml
25ml
50ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
10ml
15ml
20ml
吸附柱AC
室温
50个
100个
200个
收集管(2ml)
室温
50个
100个
200个

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 第一次使用时,将试剂盒所带的全部RNaseRNase A加入溶液P1后(终浓度100ug/ml)置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
2. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好,            可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
 
注意事项:
1. 本试剂盒适用菌株为XL-1 Blue和DH5α等核酸酶含量低缺陷型菌株。所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株,核酸酶含量丰富,应购买本公司生产的高纯度质粒小量快速提取试剂盒。
 
2. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
 
3. 溶液P3中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
 
4. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒,建议接种单菌落于1.5-4.5ml加合适抗生素的LB培养基,过夜培养14-16个小时,可提取出多达20µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应适当加大菌体使用量,使用5-10ml过夜培养物,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,其它步骤相同。
 
5. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
 
6. 质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道其确切大小。
 
7. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保PH大于7.5,PH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,PH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)

提示:
²        第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
²        将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。
²        将溶液 P3 放在冰上预冷。
 
1. 取1.5-4.5ml过夜培养的菌液,9,000rpm离心30秒,尽可能的倒干上清,收集菌体。
收集超过1.5 ml菌液,可以离心弃上清后,在同一个1.5ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
 
2. 用250μl溶液P1重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
 
3. 加 250μl的溶液P2,温和地上下翻转4-7次使菌体充分裂解,室温放置4分钟。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。
 
4. 加350μl溶液P3,立即温和地上下翻转4-7 次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰上静置3-5分钟,13,000rpm离心10分钟,小心取上清。
加入溶液P3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
 
5. 将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
 
6. 加入500μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
7. 加入500μl漂洗液WB,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
8. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于30μl,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
 
 
 
 
质粒DNA产量低
* 忘加抗生素,非质粒转化细胞过度生长-建议:确保固体、液体培养基中都加入了适当的抗生素。
* 细菌培养时间太长,老化细菌开始裂解-建议:接种过夜培养的新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中,培养12-16个小时。
* 使用了低拷贝数质粒-建议:使用高拷贝数质粒,低拷贝数质粒应该适当加大处理体积。
* 细菌培养时间过短,细菌浓度过低-建议:细菌培养到[A600]吸光值为2-4时,收集菌体。
* 细菌细胞裂解不完全-建议:使用建议的菌体处理量,不要过量;涡旋或者吹打,确保菌体充分重悬于溶液P1中,不应该见到未散开的细菌团块;加入裂解液P2后,应该是粘稠和透明的。
* 质粒DNA产量使用分光光度计定量不准确-建议:分光光度计定量常常偏高,使用琼脂糖电泳/EB染色定量。
* 洗脱效率不高-建议:请阅读操作步骤8和注意事项6。
未提取到质粒
DNA
* 漂洗液WB中忘加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇
* 质粒洗脱液含有较多乙醇,琼脂糖电泳/EB 染色定量时质粒DNA漂出上样孔-建议:确保已经做了步骤 8,将离心吸附柱的残留乙醇去除;或者适当提高上样缓冲液浓度。
质粒DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
* 忘记做步骤8,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤8,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
* 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心1分钟,小心取上清使用。
质粒DNA降解
或者无质DNA
* 核酸酶活性太高-建议:请选用本公司的高纯度质粒提取试剂盒(附带去核酸酶的去蛋白液PE)
基因组DNA污染
* 裂解时基因组DNA被剪切打断了-建议:做步骤3时,轻柔颠倒混匀,不要涡旋或者剧烈震荡
质粒DNA缺口或者电泳时超螺旋带前出现变性质粒带
 
* 步骤3裂解时间过长-建议:裂解时间不要超过5分钟。
产物中含有RNA污染
 
* 第一次做实验时,忘记将RNase A加入P1溶液,RNase A失活或者起始处理量过量-建议:第一次实验前确保将RNase A加入了溶液P1;P1溶液超过3个月的,可加入一些新RNase A;处理量不要过量;菌体重悬于P1溶液后可放置几分钟让RNase A充分作用后再进行下一步。