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大型大量质粒提取试剂盒(溶液型…

产品编号: CC9770

产品包装: 20次

产品价格: 1120元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于大规模质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
20
RNaseA(10mg/ml)
-20℃
1.3ml
溶液P1
4℃
130ml
溶液P2
室温
100ml
溶液PⅢ
室温
110ml
杂质清除剂A
室温
3ml
杂质清除剂B
室温
30ml
内毒素清除剂
-20℃
10ml

本试剂盒在室温储存 18 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 第一次使用时,将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后(终浓度100μg/ml)置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
2. 内毒素清除剂在4℃可保存一个月,如果要长期保存,建议保存在-20℃!
3. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA,采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂,只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质,获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右,得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在
Eppendorf管中操作,方法简单,不需特殊设备,无需过柱,不用酚氯仿抽提;基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒,不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA,对质粒损伤小,即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒,只要碱裂解法能够提取,就可以有效纯化。可选择任意小体积溶解质粒,浓度可高达3μg/μl。
 
产品特点:
1.     不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。快速、方便、从150-200ml大肠杆菌LB((Luria-
Bertani)培养液中,可快速提取0.4-1mg纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达80-90%。
2. 获得的质粒产量高,超螺旋比例高,纯度好,可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
3. 内毒素含量极低(<10EU/μg DNA),可直接应用于细胞转染。
 
注意事项:
1. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2. 提取大质粒时操作动作要轻柔,应该使用剪大了开口的吸头,防止机械剪切对DNA 的损坏。
3. DNA沉淀液沉淀离心后,可能看不到明显沉淀。如未见沉淀,担心DNA丢失,可保留上清液,待完成全部操作后电泳鉴定,以确定是否获得终产物(数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上,可能无法看到明显团块)。
4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/
ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为 2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。
5. 质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道确切大小。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
²        提示:将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,使用后置于2-8℃保存。
1. 取过夜培养菌150ml左右菌液(最大不超过180ml-200ml),装入合适的离心瓶中,10,000xg于4℃离心2min沉淀菌体,完全弃除上清。
 
2. 加入5ml溶液P1,充分混悬震荡菌体沉淀,使其完全分散开,至无絮块存在。细菌悬液移入50ml离心管中,室温放置3~5min。
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
 
3. 加入5ml溶液P2,轻轻颠倒离心管6~8 次,室温放置5min,使细菌完全裂解,溶液透明。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
 
4. 加5ml溶液 PⅢ,立即颠倒离心管6~8 次,充分混匀,至白色絮状物产生。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000xg离心10~15min,小心吸出上清,移入新的50ml离心管中。
加入溶液PⅢ后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀,如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
 
5. 加入10ml异丙醇,颠倒离心管,充分混匀。
 
6. 于4℃ 12,000~16,000xg离心10min,小心弃去上清,倒置轻轻沥干残余液体,加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍,最高速离心5分钟,弃上清,晾干沉淀。
DNA沉淀如果干燥过头,DNA将无法完全溶解,但是如果乙醇没有晾干挥发干净,残留太多,也会造成DNA无法完全溶解。
 
7. 加入1.4ml溶液P1完全溶解沉淀团块(可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。移入新的1.5ml离心管中。
 
8. 最高速离心2分钟,取上清转入2个新的1.5ml离心管中(每个700μl)。每管加入55μl杂质清除液A,颠倒充分混匀。
 
9. 加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的内毒素清除剂到,颠倒旋转7-10次(30秒左右)充分混匀,冰浴或者冰上放置>=5分钟,中间偶尔颠倒混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮。
 
10. 42℃水浴,溶液又会变为浑浊,颠倒混匀后42℃温育5分钟。
 
11. 室温16,000xg离心5min分相(温度低时,内毒素清除剂无法分相,因此必须至少20℃以上室温离心)。
 
12. 溶液必须分为上下两相,否则应重复步骤10-11。上层水相含DNA,下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层,里面含内毒素等杂质),弃油状层。
 
13. 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B(约750μl),轻柔混匀,4℃ 16,000xg离心10min,弃上清(注意不要丢失DNA),轻轻加入1ml 70%乙醇洗涤,离心弃上清,共两次,室温倒置晾干5~10min使乙醇完全挥发。
 
14. 加适量TE或者纯水(200~400μl)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡以辅助溶解)。要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上,即使看不见,也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。