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酵母基因组DNA快速提取试剂盒离心…

产品编号: CC9785

产品包装: 50次

产品价格: 405元/505(带蛋白酶K)/550(带lyticase)/655…

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  • 产品简介
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 产品编号: CC9785
产品包装: 50次
产品价格: 405元/505元(带蛋白酶K)/550元(带lyticase)/655元(带蛋白酶K和lyticase)


适用范围:
适用于快速提取各种酵母基因组DNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
缓冲液YB
室温
20ml
结合液CB
室温
11ml
抑制物去除液IR
室温
25ml
漂洗液WB
室温
15ml   
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
15ml
Lyticase 10U/μl
-20℃
2500U
蛋白酶K粉(可选)20mg/ml
-20℃
20mg
吸附柱AC
室温
50个
收集管(2ml)
室温
50个

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状(20mg),收到后,可短暂离心后,加入1毫升灭菌水溶解配制成20mg/ml溶液,因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存,-20℃保存。
3. 为避免降低活性,方便运输,提供Lyticase(2500U)为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入0.25毫升灭菌水溶解配制成 10U/μl,因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存,-20℃保存。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统,适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。酵母细胞经lyticase 处理去除细胞壁后,独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速,简捷,单个样品裂解后操作一般可在30分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。
 
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
2. 需要自备乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇。
3. 开始实验前将需要的水浴先预热到37℃和70℃备用。
4. 结合液CB和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 用户需要自备Sorbitol buffer(1M 山梨醇,0.1M Na2EDTA,14mMβ-巯基乙醇)。配制方法:在 600ml去离子水里面溶解182.2 克山梨醇,加入200ml 0.5 M Na2EDTA(PH8.0) ,不需要调节PH值,定容到1L,4℃保存。临用前加0.1%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。
6. 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2×107cells/ml,由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大,以上仅供参考。
7. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批PH大于7.5,PH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,PH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
²        第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
²        吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巯基乙醇,回复到室温备用。
1.       取1-3毫升酵母培养物(不超过3×107cells,最好是早对数生长期),12,000rpm离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。
收集超过1.5毫升菌液,可以离心弃上清后,在同一个1.5ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
 
2.     加入600μl Sorbitol buffer,轻柔吹打充分重悬细胞;可按照20-50U/1×107cells的比例加入Lyticase
(一般3ml培养物可能需要加到150U),充分颠倒混匀,37℃温育至少30分钟消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致DNA产量低,可以加大lyicase用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间来提高效果,不适合Lyticase消化的酵母可选用Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋,煮沸,反复冻融等。
 
3. 13,000rpm离心1分钟,尽可能吸弃上清,加180μl缓冲液YB充分重悬细胞团。
 
4. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml),立刻涡旋振荡充分混匀。
 
5. 将混合物放置在55℃水浴消化直到消化完全,期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
所需消化时间和酵母数量、种类和生长状态有关,一般15分钟即可,但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。
可选步骤,一般不需要:如果RNA残留较多,需要去除RNA,可在完成操作步骤5后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
 
6. 加入200μl结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,70℃放置10分钟。
 
7. 冷却后加入100μl异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
 
8. 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
 
9. 加入500μl抑制物去除液IR,12,000rpm离心30秒,弃废液。
 
10. 加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
11. 加入500μl漂洗液WB,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
12.将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
13. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好),室温放置3-5分钟,12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
 
14. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
 
 
 

DNA产量低
* 某些种类酵母裂解困难-建议:仔细阅读步骤2,确认处理的酵母种类可以用lyticase裂解,还可以考虑选用其它裂解方法如Zymolase、玻璃珠涡旋、煮沸、反复冻融等,lyticase最好按照使用量分装冻存,保证有效性,使用早对数生长期酵母。
* 蛋白酶K失效了-建议:按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融,延长处理时间。
* 裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议:加入结合液后,和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀;加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱,如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。
DNA降解了
* 组织中核酸酶活性导致降解-建议 :样品处理前妥善保存在-20℃,处理量不要过量。
未提取到DNA
* 漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。

洗脱下来的
DNA产量低
* 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇-建议:确保做了步骤12,否则残留乙醇会影响洗脱效率。
* 使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液-建议:仔细阅读注意事项7和步骤13和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。
A260吸光值异常偏高
* 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
 
DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
* 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
* 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议:确保做了步骤12,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。