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酵母高纯度质粒小量快速提取试剂…

产品编号: CC9752

产品包装: 50次

产品价格: 280元/440元(带lyticase)

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于酵母小规模质粒制备(mini preparations)
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
RNaseA(10mg/ml)
-20℃
150µl
Lyticase
-20℃
2500U
溶液YP1
4℃
15ml
溶液YP2
室温
15ml
溶液YP3
室温
20ml
去蛋白液PD
室温
25ml
漂洗液WB
室温
15ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
15ml
吸附柱AC
室温
50个
收集管(2ml)
室温
50个

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 第一次使用时,将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1(终浓度100µg/ml)置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活,提取的质粒可能会有微量RNA残留,在溶液YP1中补加RNase A即可。
2. 环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
3. 为避免降低活性,方便运输,提供 Lyticase(2500U)为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入0.25毫升灭菌水溶解配制成10U/ul,因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存,-20 ℃保存。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合lyticase特异消化酵母细胞壁,能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好,可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
2. 溶液YP3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3. 通常酵母质粒拷贝数都很低,高拷贝质粒最大得率一般为每5ml培养物提取1ug左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为:1-5ul用做PCR模板;5-10ul用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。
4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50
ug/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
5. 用户需要自备Sorbitol buffer(1M 山梨醇,0.1M Na2EDTA,14mMβ-巯基乙醇)。配制方法:在600ml去离子水里面溶解182.2克山梨醇,加入200ml 0.5M Na2EDTA(PH8.0) ,不需要调节PH值,定容到1L,4℃保存。临用前加 0.1% β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。
6. 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2×107cells/ml,由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大,以上仅供参考。
7. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批PH大于7.5,PH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,PH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
 

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
²        第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
²        将RNase A全部加入溶液YP1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。
²        将YP3溶液放在冰上预冷。
²        吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1% β-巯基乙醇,回复到室温备用。
 
1. 取1.5-5毫升酵母培养物(不超过5×107cells),9,000rpm离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。
收集超过1.5毫升菌液,可以离心弃上清后,在同一个1.5ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
 
2. 加入600ul Sorbitol buffer,轻柔吹打充分重悬细胞;可按照20-50U/1×107cells的比例加入Lyticase(一般5ml培养物可能需要加到 200U),充分颠倒混匀,37℃温育至少30分钟消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致质粒产量低,可以加大lyicase用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间来提高效果,不适合Lyticase消化的酵母可选用Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋,反复冻融等。
 
3. 13,000rpm离心1分钟,尽可能吸弃上清,加入250ul溶液YP1重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
 
4. 加250ul的溶液YP2,温和地上下翻转4-7次使菌体充分裂解,室温放置4分钟。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。
 
5. 加350ul溶液YP3,立即温和地上下翻转4-7次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰上静置3-5分钟,13,000rpm 离心10分钟,小心取上清。
加入溶液YP3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
 
6. 将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
 
7. 可选步骤:加入500ul去蛋白液PD,12,000rpm离心30-60秒,弃废液。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质,如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株,核酸酶含量丰富,应加此步骤;如所用菌株为XL-1 Blue和DH5α等缺陷型菌株,核酸酶含量低,则可略过此步骤。
 
8. 加入700ul漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30-60秒,弃掉废液。
 
9. 加入500ul漂洗液WB,12,000rpm离心30-60秒,弃掉废液。
 
10. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
11. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在             65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,13,000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50ul,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
 
 
 
 
 
 
质粒DNA产量低
* 忘加抗生素,非质粒转化细胞过度生长-建议:确保固体、液体培养基中都加入了适当的抗生素
* 细菌培养时间太长,老化细菌开始裂解-建议:接种过夜培养的新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中,培养12-16个小时
* 使用了低拷贝数质粒-建议:使用高拷贝数质粒,低拷贝数质粒应该适当加大处理体积
* 细菌培养时间过短,细菌浓度过低-建议:细菌培养到[A600]吸光值为2-4 时,收集菌体
* 细菌细胞裂解不完全-建议:使用建议的菌体处理量,不要过量;涡旋或者吹打,确保菌体充分重悬于溶液YP1中,不应该见到未散开的细菌团块;加入裂解液YP2后,应该是粘稠和透明的
* 某些种类酵母裂解困难-建议:仔细阅读步骤2,确认处理的酵母种类可以用lyticase裂解,还可以考虑选用其它裂解方法如Zymolase、玻璃珠涡旋、反复冻融等,lyticase最好按照使用量分装冻存,保证有效性
* 质粒DNA产量使用分光光度计定量不准确-建议:分光光度计定量常常偏高,使用琼脂糖电泳/EB染色定量
* 洗脱效率不高-建议:请阅读实验步骤10和注意事项7

未提取到质粒DNA
* 漂洗液WB中忘加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇
* 质粒洗脱液含有较多乙醇,琼脂糖电泳/EB染色定量时质粒DNA漂出上样孔-建议:确保已经做了步骤10,将离心吸附柱的残留乙醇去除;或者适当提高上样缓冲液浓度
质粒DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
* 忘记做步骤10,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤10,之后在空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发
* 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm 再离心1分钟,小心取上清使用
质粒DNA降解
或者无质粒DNA
* 核酸酶活性太高-建议:确保已经做了步骤7,使用去蛋白液PD去除核酸酶
基因组DNA
污染
* 裂解时基因组DNA被剪切打断了-建议:做步骤4时,轻柔颠倒混匀,不要涡旋或者剧烈震荡
质粒DNA缺口或者电泳时超螺旋带前出现变性质粒带

* 步骤4裂解时间过长-建议:裂解时间不要超过5分钟

产物中含有RNA
污染
 
* 第一次做实验时,忘记将RNase A 加入YP1溶液,RNase A失活或者起始处理量过量-建议:第一次实验前确保将RNase A加入了溶液YP1;YP1溶液超过3个月的,可加入一些新RNase A;处理量不要过量;菌体重悬于YP1溶液后可放置几分钟让RNase A 充分作用后再进行下一步