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    合肥市蜀山区槽郢路微商学院14号4栋2单元203室

无内毒素高纯质粒大量提取试剂盒…

产品编号: CC9758

产品包装: 10次

产品价格: 850元

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  • 产品简介
  • 使用说明
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适用范围:适用于大规模质粒制备(max preparations)
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
10
RNaseA(10mg/ml)
-20℃
750ul
溶液P1
4℃
75ml
溶液P2
室温
75ml
溶液PⅢ
室温
110ml
结合液PB
室温
120ml
内毒素清除剂
-20℃
50ml
去蛋白液PD
室温
100ml
漂洗液WB
室温
25ml×2
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
20ml
吸附柱AC
室温
10个
收集管(50ml)
室温
10个

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
    1. 第一次使用时,将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后(终浓度100ug/ml)置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
    2. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
    3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素,然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
    1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。快速,方便,从100-200ml大肠杆菌 LB(Luria-
Bertani)培养液中,可快速提取0.2-0.5mg纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达80-90%。
3. 独特工艺配方清除内毒素,内毒素含量极低(<10EU/ug DNA),细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。
 
注意事项:
    1. 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成,使用转速可以达到12000xg,带50ml转头的台式离心机。
    2. 结合液PB含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
    3. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量,洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间,以增加提取效率。
4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50ug/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
    5. 质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道其确切大小。
6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保PH大于7.5,PH过低影响洗脱效率。用水洗脱,质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,PH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
    7. 无内毒素清除剂清除内毒素后,质粒产量会有损失,根据不同的宿主菌株会损失10%-30%不等的质粒产量。
 

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
²        第一次使用前请先在2瓶漂洗液WB瓶中分别加入100ml无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
²        将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。
²        将PⅢ溶液放在冰上预冷。
1. 取 150-200 毫升过夜培养的菌液,12,000xg(约 10,000rpm),离心 1-2 分钟,尽可能的倒干上清,收集菌体。
收集超过50毫升菌液,可以离心弃上清后,在同一个50ml管内加入更多的菌液,重复步骤11,直到收集到足够的菌体。
 
2. 用7ml溶液P1重悬菌体沉淀,移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
 
3. 加7ml的溶液P2,温和地上下翻转4-7次使菌体充分裂解,室温放置3-5分钟。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
 
4. 加10ml溶液PⅢ,立即温和地上下翻转4-7次,充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。室温或者冰上静置5分钟,4℃,12,000xg离心15分钟,小心取上清,避免吸取到漂浮白色沉淀。
加入溶液PⅢ后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀,如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
 
5. 可选步骤(一般不需要做):4℃,12,000xg再次离心10分钟,小心取上清。
 
6. 加入0.1体积冰预冷的内毒素清除剂到上一步所得上清,颠倒旋转混匀7-10次,冰浴或者冰上放置5分钟,中间偶尔颠倒混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮。
 
7. 42℃水浴,溶液又会变为浑浊,颠倒混匀后42℃温育5分钟。
 
8. 室温15,000xg离心10min分相(温度低时,内毒素清除剂无法分相,因此必须至少20℃以上室温离心)。
 
9. 溶液必须分为上下两相,否则应重复步骤7-8。上层水相含DNA,下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层,里面含内毒素等杂质),弃油状层。
 
10. 将上一步所得上层水相中加入0.5体积结合液PB后充分涡旋混匀后分多次(每次不超过15ml)转入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),12,000xg离心1分钟,倒掉收集管中的废液。
 
11. 加入10ml去蛋白液PD,12,000xg离心1分钟,弃掉废液。
 
12. 加入10ml漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000xg离心1分钟,弃掉废液。
 
13. 重复操作步骤12一次。
 
14. 将吸附柱AC放回空收集管中,最高速(最好大于12,000xg)离心5分钟以干燥基质膜上残留乙醇,用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇,室温或者37℃烘箱晾干几分钟。
该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇,残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率,降低质粒产量。如果洗脱产量低,则必须加做步骤15。
 
15. 可选步骤:选择以下两种方法之一干燥柱子:
    1) 取下柱子放置于真空容器中,密封真空容器,提供真空15分钟;
    2) 将柱子放置于65℃真空干燥箱或烘箱中,放置10分钟。
 
16. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加1-2ml洗脱缓冲液 EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好),室温放置2-5分钟,12,000xg离心5分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心2分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
 
 
 
 
 
质粒DNA产量低
*忘加抗生素,非质粒转化细胞过度生长-建议:确保固体、液体培养基中都加入了适当的抗生素
*细菌培养时间太长,老化细菌开始裂解-建议:接种过夜培养的新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中培养12-16个小时
*使用了低拷贝数质粒-建议:建议使用高拷贝数质粒,低拷贝数质粒应该适当加大处理体积
*细菌培养时间过短,菌液内细菌浓度过低-建议:细菌培养到[A600]吸光值为2-4的时候收集菌体
*细菌细胞裂解不完全-建议:使用建议的菌体处理量,不要过量;涡旋或者吹打,确保菌体充分重悬于溶液P1中,不应该见到未散开的细菌团块;加入裂解液P2裂解后,应该是粘稠和透明的
*质粒DNA产量使用分光光度计定量不准确-建议:分光光度计定量常常偏高,使用琼脂糖电泳/EB染色定量
*洗脱效率不高-建议:请阅读实验步骤15和注意事项6

未提取到质粒DNA
*漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇
*质粒洗脱液含有较多乙醇,琼脂糖电泳/EB染色定量时质粒DNA漂出上样孔-建议:确保已经做了步骤14,将离心吸附柱的乙醇残留去除;或者适当提高上样缓冲液浓度
质粒DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
*忘记做步骤14,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤14,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。加做步骤15
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心1分钟,小心取上清使用
基因组DNA
污染
*裂解时基因组被剪切打断了-建议:做步骤3时轻柔的通过颠倒混匀,不要涡旋或者剧烈震荡
质粒DNA上缺口或者电泳上超螺旋带前出现变性质粒带
 
*步骤3裂解时间过长-建议:裂解时间不要超过5分钟
 
产物中含有RNA污染
*第一次做实验时候,忘记将RNase A加入P1溶液,RNase A失活或者起始处理量过量-建议:第一次实验前确保将RNase A加入了溶液P1;P1溶液超过3个月的,可加入一些新RNase
A在溶液P1;处理量不要过量;菌体重悬于P1溶液后可放置几分钟让RNase A充分起作用后再进行下一步