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BAC/PAC大型质粒提取试剂盒(溶液…

产品编号: CC9759

产品包装: 20 次

产品价格: 1120元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 适用范围:适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型质粒制备

 
试剂盒组成、储存、稳定性:                           

试剂盒组成
保存
20次
RNaseA(10mg/ml)
-20℃
1.3ml
溶液P1
4℃
130ml
溶液P2
室温
100ml
溶液PⅢ
室温
110ml
杂质清除剂A
室温
3ml
杂质清除剂B
室温
30ml
内毒素清除剂
-20℃
10ml

本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 第一次使用时,将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后(终浓度100ug/ml)置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
2. 内毒素清除剂在4℃可保存一个月,如果要长期保存,建议保存在-20℃!
3. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子
 
产品介绍:常规的离心柱型质粒抽提试剂盒并不适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型质粒DNA的抽提。这主要是因为大型质粒DNA分子量很大,常常会超过100kb而且一般拷贝数低产量低,使用常规的离心柱吸附膜吸附效率和产量很低而且过膜会打断这些大分子量的质粒 DNA。本试剂盒采用改进碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA,采用
独特的溶液配方和内毒素清除试剂,只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质,获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右,得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在Eppendorf管中操作,方法简单,不需特殊设备,无需过柱,不用酚氯仿抽提;基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒,不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA,对质粒损伤小,即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒,只要碱裂解法能够提取,就可以有效纯化。此外溶液型的试剂可以按照比例放大缩小进行小提/中提/大提,最后可选择任意小体积溶解质粒,浓度可高达3ug/ul。
 
产品特点:
1. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。快速、方便、从150ml大肠杆菌 LB((Luria-
Bertani)培养液中,可快速提取典型产量30-50ug高纯度BAC质粒DNA,提取率达80-90%。
2. 获得的质粒产量高,超螺旋比例高,纯度好,可直接用于转染、测序、文库等各种分子生物学实验。
3. 内毒素含量极低(<10 EU/ug DNA),可直接应用于细胞转染。
 
注意事项:
1. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2. 提取大质粒时操作动作要轻柔,应该使用剪大了开口的吸头,防止机械剪切对DNA的损坏。
3. DNA沉淀液沉淀离心后,可能看不到明显沉淀。如未见沉淀,担心DNA丢失,可保留上清液,待完成全部操作后电泳鉴定,以确定是否获得终产物(数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上,可能无法看到明显团块)。
4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50ug/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。

 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)

²        提示:将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,使用后置于2-8℃保存。
²        操作需使用剪后的大口径的吸头或者吸管,十分轻柔,以避免剪切断DNA。
 
1. 取过夜培养菌<150ml菌液,装入合适的离心瓶中,10,000xg于4℃离心2min沉淀菌体,完全弃除上清。
 
2. 加入5ml溶液P1,充分混悬震荡菌体沉淀,使其完全分散开,至无絮块存在。细菌悬液移入50ml离心管中,室温放置3~5min。
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
 
3. 加入5ml溶液P2,轻轻颠倒离心管6~8次,室温放置5分钟,使细菌完全裂解,溶液透明。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
 
4. 加5ml溶液PⅢ,立即颠倒离心管6~8 次,充分混匀,至白色絮状物产生。冰上放置5分钟。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000xg离心10~15min,小心吸出上清,移入新的50ml离心管中。
加入溶液PⅢ后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀,如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
 
5. 加入10ml异丙醇,颠倒离心管,充分混匀(可选:室温放置10min)。
 
6. 于4℃ 12,000~16,000xg离心10min,小心弃去上清,倒置轻轻沥干残余液体,加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍,最高速离心5分钟,弃上清,晾干沉淀。
DNA沉淀如果干燥过头,DNA将无法完全溶解,但是如果乙醇没有晾干挥发干净,残留太多,也会造成DNA无法完全溶解。
 
7. 加入1.4ml溶液P1完全溶解沉淀团块(可用宽口吸管十分轻柔轻轻吹打辅助溶解)。移入新的1.5ml离心管中,60℃水浴放置10min。
室温或60℃水浴放置10分钟,该步骤为去除可能的RNA残留,大多情况可省去。
 
8. 最高速离心2分钟,取上清转入2个新的1.5 ml离心管中(每个700ul)。每管加入55ul 杂质清除液A,颠倒充分混匀。
9. 加入约0.1体积(约80ul)冰预冷的内毒素清除剂到,颠倒旋转7-10次(30秒左右)充分混匀,冰浴或者冰上放置>=5分钟,中间偶尔颠倒混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮。
 
10. 42℃水浴,溶液又会变为浑浊,颠倒混匀后42℃温育5分钟。
 
11. 室温16,000xg离心5分钟分相(温度低时,内毒素清除剂无法分相,因此必须至少20℃以上室温离心)。
 
12. 溶液必须分为上下两相,否则应重复步骤10-11。上层水相含DNA,下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层,里面含内毒素等杂质),弃油状层。
 
13. 可选步骤: 根据对内毒素指标的要求重复抽提1次,即重复步骤9-12清除内毒素1次,该步骤可以提高纯度,但是会损失一定量的质粒DNA,请根据具体需要选择使用(一般不需要)。
 
14. 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B(约750ul),轻柔混匀后冰上放置10~30min(注意:冰上放置可能稍微提高一些产量,一般情况不是特别要提高产量不需要冰上放置,可略去该步骤),4℃ 16,000xg离心10min,弃上清(注意不要丢失DNA),轻轻加入1ml 70%乙醇洗涤,离心弃上清,共两次,室温倒置晾干5~10     min使乙醇完全挥发。
 
15. 加适量TE或者纯水(100~200ul,可根据实验对浓度的要求增加减少溶解体积)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡1-2h以辅助溶解)。要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上,即使看不见,也应该使用大口径吸头十分轻柔吹打(避免剪切打断质粒)侧壁溶解回收质粒DNA。或者用手指不时轻弹管壁,旋转晃动让溶液充分和管壁接触来溶解回收质粒DNA。