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    合肥市蜀山区槽郢路微商学院14号4栋2单元203室

中量全血基因组DNA提取试剂盒  C…

产品编号: CC9768

产品包装: 20次×3ml、50次×3ml…

产品价格: 580元/1100元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于快速提取各种动物全血基因组DNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
20次×3ml
50次×3ml
10×红细胞裂解液
室温
20ml
45ml
细胞核裂解液
室温
60ml
150ml
蛋白沉淀液
室温
20ml
50ml
DNA溶解液
室温
10ml
20ml

本试剂盒在室温储存 18 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
1. 环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
2. 蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,如果不能完全溶解,也不影响使用效果,直接取用上层溶液即可。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组 DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞,细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA,然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白,最后纯净的基因组                      DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。
 
产品特点:
1. 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方,裂解快速完全。
2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂。
3. 快速,简捷,单个样品操作一般可在1小时内完成。
4. 结果稳定,产量高(典型的产量3ml全血可提取出50-150ug),OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9 ,长度可达50Kb-150kb,可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
 
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到2,500xg,并配备容纳15ml离心管转头的传统台式离心机。
2. 用户需自备异丙醇和70%乙醇。
3. 典型的产量3ml全血可提取出75-150ug基因组DNA(不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大,因此产量的个体差异也可能非常大)。
4. 本试剂盒为溶液型,可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量(20ul-10ml),请联系我们索取其它处理量的操作手册。
5. 本试剂盒可运用于多种抗凝剂的全血,如EDTA、柠檬酸、肝素抗凝血。其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬,影响裂解效果,建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本
6. 为了最佳效果,最好使用新鲜血液标本或者4℃存放小于3天的标本,不要使用反复冻融超过3次的标本,否则会严重降低产量。
7. 对于每个样品提取血量大或者用量大的客户,可以和我们联系,我们另有专门准备有优惠的大包装试剂。
 

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
1. 吸取9ml 1×红细胞裂解液到一个15ml离心管。
使用前应该用去离子水将10×红细胞裂解液稀释 10倍到1×。
 
2. 将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后,吸取3ml加到上步装有红细胞裂解液离心管中,颠倒6-8次,并倒置轻弹管壁,确保充分混匀。
 
3. 室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞)。
 
4. 2,500xg离心2分钟,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团和大约50ul的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入适量红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3,4。
 
5. 涡旋振荡直到白细胞团充分重悬、分散。
白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要,白细胞未打散就加入裂解液,会导致白细胞不能充分裂解,形成肉眼可见团块。
 
6. 加入 3ml 细胞核裂解液到重悬的白细胞,上下吹打裂解白细胞,或者剧烈涡旋 10秒帮助裂解白细胞。
 
7. 可选步骤:在裂解物中加入RNase A(10mg/ml)至终浓度30ug/ml,颠倒25次混匀,37℃温育15分钟去除残留RNA,然后冷却回室温
 
8. 加入1ml蛋白沉淀液后,在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。
 
9. 2,500xg(可根据需要调整加大离心力)离心5分钟。这时候应该可以见到管底暗褐色的蛋白沉淀,也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。
 
10. 小心吸取上清(大约3ml)到一个新的15ml离心管中。
吸取上清时,注意不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀。如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中,可再次离心2分钟后取上清。
 
11. 加入等体积的室温异丙醇(3ml),轻柔颠倒 30 次混匀或者直到出现棉絮状(丝状)白色DNA沉淀。
 
12. 2,000xg离心3分钟,在管底可以见到白色的DNA沉淀块,倒弃上清。
 
13. 加入3ml 70%乙醇,颠倒几次漂洗DNA沉淀,2,000xg离心1分钟,倒去上清(沉淀很松,注意不要把DNA沉淀倒掉了),倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇,还可以用枪头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇,空气晾干沉淀几分钟。
注意不要干燥过头,否则DNA极其难溶;也不能残留太多乙醇,否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。
 
14. 加入250ul DNA溶解液(如果需要浓度高,可根据需要减少DNA溶解液用量)重新水化溶解DNA沉淀,轻弹管壁混匀,可以放置在65℃温育30-60分钟(不要超过一小时),也可以在室温或者4℃放置过夜来重新水化DNA,中间不时的轻弹管壁帮助重新水化DNA。
 
15. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
标本中含有
血凝块
*不恰当的存放标本,未充分混匀,未使用合适的抗凝剂-建议:丢弃有血凝块的标本,重新用EDTA,肝素,柠檬酸抗凝剂收集血液

红细胞裂解
不完全
*血液标本裂解前没有回复到室温-建议:处理前先把血液标本回复到室温
*裂解时间不够-建议:可延长裂解时间至15分钟以上
*没有充分混匀-建议:裂解过程中可以更多次颠倒混匀,或者轻弹管壁帮助裂解




DNA产量低
*血液标本中本身含有的白细胞数量低-建议:增加起始血液处理量
*白细胞裂解不完全-建议:仔细阅读步骤6的操作要领。加入裂解液之前,必须剧烈涡旋振荡,打散重悬白细胞沉淀团块,否则很难裂解完全。如果是肝素抗凝的血样,白细胞团块很难打散,加入裂解液后应该在 65℃温育帮助裂解直到看不见细胞团块。白细胞数量太大超出裂解能力,适当增加细胞核裂解液体积
*血液标本存放时间太长-建议:存放在4℃的血液标本超过5天的产量可能大大降低,因此不要存放太久
*DNA 沉淀在洗涤的时候丢失了-建议:异丙醇沉淀后用乙醇洗涤的过程中,倒弃上清的时候要格外小心,不要把 DNA 沉淀也倒掉了

DNA长度
小于20kb
*血液样品太老或者不正确的存放,造成DNA降解-建议:选用新鲜的血液样品
*操作不当,造成对基因组DNA的剪切-建议:混匀轻柔,不可以用手剧烈振荡离心管,选用大口径的枪头转移或者混匀DNA

未见到蛋白
沉淀
*加入蛋白沉淀液前,裂解混合物没有冷却回室温-建议:冷却至室温或者冰上放置5分钟后再加入蛋白沉淀液
*蛋白沉淀液没有和裂解混合物充分混匀-建议:应该连续高速涡旋振荡混匀25秒,涡旋并不会剪切断DNA


A260/A280
<1.6
*污染有蛋白质-建议:看看上述“未见到蛋白沉淀”问题的评论与建议,确保蛋白通过沉淀去除。另外请参见步骤10,防止蛋白污染
*测定吸光值时用水稀释DNA会降低A260/A280-建议:使用TE缓冲液来稀释DNA,保证PH值大于8.0


DNA沉淀难以
重新溶解水化
*晾干DNA沉淀时过度了-建议:晾干时密切观察,不要干燥过头,注意应该观察管底的DNA沉淀,有时候管壁上的残留乙醇已经挥发,但留下一些水分还没有干,只要管底DNA干了就可以加入DNA溶解液。可在65℃温育帮助重新溶解(不要超过一小时)然后室温或者4℃放置过夜,期间可以颠倒轻弹帮助溶解
下游酶切
切不开
*DNA未干燥完全,残留乙醇太多-建议:敞开离心管口,在65℃温育几分钟,让乙醇挥发