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细菌基因组DNA快速提取试剂盒  C…

产品编号: CC9776

产品包装: 50次、100次、200次

产品价格: 320/420元(带蛋白酶K)、520/720元(带蛋白…

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  • 产品简介
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包装单位:50次、100次、200次

产品价格:320/420元(带蛋白酶K)、520/720元(带蛋白酶K)、1000/1400元(带蛋白酶K)
 
适用范围:适用于快速提取各种细菌基因组DNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
100
200
缓冲液RB
室温
30ml
60ml
120ml
结合液CB
室温
11ml
20ml
40ml
抑制物去除液IR
室温
25ml
50ml
100ml
漂洗液WB
室温
15ml
25ml
2×25ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
15ml
20ml
40ml
蛋白酶K粉(可选)20mg/ml
-20℃
20mg
2×20mg
4×20mg
吸附柱AC
室温
50个
100个
200个
收集管(2ml)
室温
50个
100个
200个

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
 
储存事项:
    1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
    2. 为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入1毫升灭菌水溶解,因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存,-20℃保存。
    3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
    1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
    2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
    3. 快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
    4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30kb-50kb,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。

 

注意事项:
    1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
    2. 开始实验前根据需要将水浴预热到37℃或者70℃备用。
    3. 需要自备异丙醇。
    4. 需自备0.5M EDTA和Lysozyme(溶菌酶)(用于革兰氏阳性菌)、lysostaPHin(用于某些难裂解的革兰氏阳性菌)。
5. 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
    6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批PH大于7.5,PH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,PH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)

提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
 
1. 取0.5-2毫升培养菌液(最多不超过2×109个细胞),10,000rpm,离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。
起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整,但是离心吸附柱最大吸附能力是20ug基因组DNA,如果菌体过量超过最大吸附能力,反而会严重降低产量。
 
2. 加入200ul缓冲液RB重悬,10,000rpm离心30秒,弃上清。将细胞振荡或者吹打重悬于180ul缓冲液RB(革兰氏阴性菌)或者480ul 50mM Na2EDTA(PH8.0)(革兰氏阳性菌)。
 
3. 对于革兰氏阴性菌(可选做此步骤):加入5ul溶菌酶(20mg/ml in 10mM Tris-HCl,PH8.0) ,颠倒混匀,37℃温育15分钟。
对于革兰氏阳性菌:加入120ul溶菌酶(20mg/ml in 10mM Tris-HCl,PH8.0)颠倒混匀,37℃温育30-60分钟。12,000rpm离心2分钟,弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180ul缓冲液RB中。
对于大部分的革兰氏阳性菌如 Bacillus subtilis,Micrococcus luteus,Arthrobacter luteus,Nocardia otitidiscaviarum,Rhodococcus rhodochrous和Brevibacterium albidium,使用溶菌酶就可以有效裂解。但是对于某些种类的StaPHylococcus,则应该加入60ul溶菌酶(20mg/ml)和60ul lysostaPHin 20mg/ml)确保有效裂解。
 
4. 加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液,充分混匀,再加入200ul结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。
可选做步骤: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200ul结合液CB前加20ul RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
 
5. 冷却后加入100ul异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
 
6. 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
 
7. 加入500ul抑制物去除液IR,12,000rpm离心30秒,弃废液。
 
8. 加入700ul漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
9. 加入500ul漂洗液WB,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
10. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
11. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在            65-70℃水浴中预热效果更好),室温放置3-5分钟,12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50ul,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
 
12. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
 
 
DNA产量低
*蛋白酶K失效了-建议:收到蛋白酶K后,按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融
*裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议:加入结合液后,和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀;加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱,如果太粘稠必须涡
旋振荡15秒充分混匀
*有的革兰氏阳性菌需要特殊的酶裂解-建议:请详细参见步骤3,了解提取细菌的特性
未提取到DNA
*漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇
 
洗脱下来的DNA
产量低
*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇-建议:确保做了步骤10,否则残留乙醇会影响洗脱效率
*使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液-建议:仔细阅读仔细阅读注意事项6和步骤11和只使用洗脱缓冲液EB洗脱
A260吸光值
异常偏高
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用
 
DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用
*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议:确保做了步骤10,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发