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凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒  …

产品编号: CC9789

产品包装: 20次、50次

产品价格: 350元/650元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于快速提取凋亡DNA Ladder
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
20
50
裂解/结合液CB
室温
6ml
15ml
漂洗液WB
室温
6ml
15ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
15ml
15ml
吸附柱AC
室温
20个
50个
收集管(2ml)
室温
20个
50个

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
 
储存事项:
    1. 裂解/结合液CB低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:细胞发生凋亡时,染色质DNA在核小体之间发生断裂,最终形成200bp整数倍的DNA片段,这些DNA片段被提取后,经电泳及溴化乙锭染色后形成梯子状外观,谓之DNA Ladder。血液和组织培养细胞在裂解/结合液中裂解后,释放出来的DNA片段在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将DNA Ladder片段从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
    1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
    2. 本公司独有的裂解/结合液配方有效裂解细胞,使用本试剂盒不需要加入昂贵的蛋白酶K处理,大大降低了使用成本和加快了处理速度。
    3. 节省时间,简捷,单个样品操作一般可在10分钟内完成。
 
注意事项:
    1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
    2. 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
    3. 裂解/结合液CB含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
    4. 一般2×106培养细胞 DNA 产量为10-20ug,200ul人全血典型产量为3-6ug。
    5. 一般电泳检测时典型上样量为2-3ug纯化的DNA,如果凋亡率低,有可能只见到基因组DNA,而见不到DNA ladder,可以试试加大上样量。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
1. 取2×106个细胞(悬浮细胞或者组织培养细胞重悬在200ul PBS中)或者200ul全血(大约含有2×106个细胞)加入200ul裂解/结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀。
可选做步骤: 如果RNA残留较多,影响凋亡DNA ladder的观察,可以在加入20ul裂解/结合液CB前加 20uul RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
细胞或者全血处理起始量最大可达300ul,如果起始量介于200u-300ul之间,则需要按比例相应提高后面使用试剂量。
 
2. 室温(15℃-20℃)放置10分钟。
 
3. 加入100ul异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中适当力度充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量。如果样品粘稠不易混匀,则可以涡旋振荡15秒。
 
4. 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液。
 
5. 加入700ul漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
6. 加入500ul漂洗液WB,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
7. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇影响洗脱效率和下游反应。
 
8. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热),室温放置3-5分钟,12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50ul,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
 
9. DNA可以直接使用或者存放在-20℃,但是不要超过14天。
 
10. 取大约2-3ug纯化的DNA电泳检测(注意200ul人全血典型产量只有3-6ug)。
 
问题与解决方法:

问题
评论与建议
没有DNA Ladder条带,只见到未凋亡细胞的基因组条带
*细胞未凋亡或者凋亡细胞率太低-建议:提高凋亡剂的浓度或者延长凋亡诱导时间

未见到DNA Ladder条带,也未见到非凋亡细胞的基因组条带
*分离的DNA产量太低-建议:加大起始细胞处理量,按比例扩大试剂使用量。确保做了步骤7,以免乙醇残留降低洗脱效率
*样品本身含有DNA量少(如人全血),电泳上样量太低,-建议:可以加大洗脱下来纯化DNA的电泳上样量
DNA弥散,
未见Ladder
*凋亡晚期,非特异的剪切DNA所致-建议:在凋亡较早期时提取DNA Ladder(或者做多个不同时期动态连续检测)
 

背景高DNA Ladder弱,
或者不明显
*RNA污染太多,影响了观测-建议:将洗脱的纯化DNA加入DNase free的RNase至终浓度2ug/ml,室温(15℃-20℃)放置20分钟降解污染的RNA。此外,正常细胞含有更多的RNA,凋亡细胞比例过低时易残留更多RNA,因此RNA残留较多,往往提示凋亡细胞比例过低,可以根据实际情况调整诱导条件