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选择性凋亡DNA Ladder抽提试剂盒…

产品编号: CC9790

产品包装: 25次、50次

产品价格: 480元、890元

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  • 产品简介
  • 使用说明
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试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
25
50
Extraction buffer
4℃
5ml
10ml
10%SDS
室温
500ul
1ml
Enzyme A
-20℃
500ul
1ml
Enzyme B
-20℃
500ul
1ml
Precipitant
4℃
3.5ml
7ml

 
注意事项:
    为保持活性方便运输 ,Enzyme B客户收到时为冻干粉,收到后加500ul灭菌水(25次)或者1ml灭菌水(50次)溶解后-20℃保存。Enzyme A和Enzyme B为酶溶液,应该避免反复冻融降低活性,如果要分多次使用,最好按照每次使用量分装后-20℃保存。
 
产品介绍:
凋亡(apoptosis)或程序性死亡的细胞一个形态学的显著特点是染色体DNA以核小体为单位(185bp)规律断裂形成长度约为n×185bp(n=1,2,3,4…) 的DNA片段,经琼脂糖凝胶电泳显示为阶梯状凋亡DNA Ladder,是凋亡细胞最直观的特征。本试剂盒选择性从组织和细胞中分离提取凋亡DNA ladder,通过选择性分离基因组DNA与凋亡DNA ladder,最大限度的减少了基因组DNA对凋亡DNA ladder的观察干扰,因此显著的提高了检测敏感度,反应可在微量离心管进行,2.5小时完成,快速方便;无需有机抽提,检测灵敏度极高,可从约2000个凋亡细胞中检测到DNA ladder。推荐起始细胞量为5~10×105个,但投入的细胞量可在1×105~5×106之间变化。原则是总细胞中应含有至少约1~2×104个凋亡细胞。多于2×104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA ladder。本试剂盒也可用于从组织中提取凋亡DNA ladder。但与培养细胞相比,整体动物组织凋亡细胞出现的时间、部位、程度等规律性差往往造成难以准确取材,可能显著影响实验结果。但只要组织确实发生凋亡,有经验的用户也可以使用本试剂盒从组织提取凋亡DNA ladder (参见说明4)。
 
产品说明:
    1. 溴化乙锭染色过度将降低DNA条带检测灵敏度,可用水冲洗凝胶10~30分钟。如冲洗过头可再用溴化乙锭复染。可用更灵敏的DNA染色剂SYBR Green。也可进行丙烯酰胺DNA凝胶电泳和DNA银染。
    2. 对细胞进行干预处理后,凋亡可能仅在某一时间点或某一干预强度下最为明显。需要进行预试验确定最佳干预时间或强度。此时也可用凋亡小体/hoeschst染色试剂盒(CC9791)快速染色凋亡小体观察。
    3. 推荐起始细胞量为5~10×105个,但投入的细胞量可在1×105~5×106之间变化。原则是总细胞中应含有至少约1~2×104个凋亡细胞。多于2×104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA ladder。六孔板的一个孔相当于一个35mm培养皿长满后可得到1~10×105个细胞,如果细胞凋亡发生率为10%,经过处理可得到约1~10×104个凋亡细胞,应该足以获得清晰的凋亡DNA ladder。反之如果不能从>3×106个细胞获得清晰的凋亡DNA ladder,表明其中凋亡细胞少于1%。此时增加细胞用量也难已奏效。
    4. 从组织块提取凋亡DNA ladder。取10~20mg组织块放入小玻璃匀浆器,加100~200ul Extraction buffer,上下手动匀浆15~20次。取出匀浆液,冰上5~10min。振荡10秒。4500rpm 10分钟收集上清液并转移到新1.5ml离心管,执行提取步骤3。另外一种方法是将30~50mg组织剪碎后在PBS里面匀浆,制成细胞悬液,离心收集细胞后接步骤2继续执行提取。
    5. 采用高质量琼脂糖,使用宽度较小和厚度较窄的样品梳子,制作较薄的琼脂糖凝胶(厚度约2~4mm);用较低的电压进行慢速电泳,将显著增加凋亡DNA条带检测灵敏度。电泳距离不要太长,否则将使小的凋亡DNA条带弥散而降低分辨率。

 

操作步骤:
1. 用PBS漂洗细胞两遍后微型离心机500xg 4℃ 5min收集5~10×105个细胞(最好同时做一个未凋亡细胞的对照)。小心用移液枪吸弃上清,除尽管壁附着液体。
 
2. 将离心管底部的细胞沉淀用手指轻轻弹松打散后,加入100ul的Extraction buffer,用振荡器激烈混合           10秒钟后,1,100~1,600xg(约3500~4500rpm)离心5分钟。
 
3. 勿触动管底沉淀,将上清液转移到新的1.5ml离心管。
 
4. 沉淀按操作2.方法再重复一次。
 
5. 把上清液与操作3.的上清液合并于一起共约200ul,作为粗提取液(含有凋亡DNA片段,未凋亡染色体DNA已经通过沉淀去除)。
 
6. 向粗提取液中加入10%SDS溶液20ul后,再加入Enzyme A 20ul,混匀,56℃温育1小时。
 
7. 向上述混合液中加入Enzyme B 20ul,混匀,37℃温育1小时,或者直到变得透亮(可过夜)。
 
8. 向上述混合液中加入Precipitant 130ul后,颠倒混匀,再加入1ml的乙醇,混匀后-20℃放置1小时以上(沉淀凋亡DNA片段)。
 
9. 至少13000rpm 4℃离心15min,弃上清,加1ml 70%乙醇漂洗一遍后离心,倒去乙醇,并且尽量吸除管壁附着液体。敞开管口,室温晾干沉淀。
 
10. 用17ul双蒸水或TE Buffer充分溶解沉淀,加3ul 6×DNA凝胶上样缓冲液震荡混匀。取全部20ul上样或者适量上样进行1% agarose gels电泳。溴化乙锭染色,紫外观察照相(凋亡发生率较低时,添加过量TE Buffer溶解沉淀有可能会导致浓度太稀,无法检出DNA Ladder,因此可减少用量,反之,可增加)。