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M13噬菌体单链基因组DNA快速提取…

产品编号: CC9794

产品包装: 50次、100次、200次

产品价格: 450元、800元、1200元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于快速提取M13噬粒单链DNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
100
200
结合液MB
室温
25ml
50ml
100ml
漂洗液WB
室温
15ml
25ml
2×25ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
10ml
20ml
40ml
吸附柱AC
室温
50个
100个
200个
收集管(2ml)
室温
50个
100个
200个

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
 
储存事项:
    1. 结合液MB低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
    2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:M13和其它的丝状噬菌体载体,在文库构建和为序列测序提供单链DNA和引人突变方面十分有用。将适量 M13 丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培养物离心,上清中的单链噬菌体 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,将盐、细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净噬菌体单链 DNA 从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
    1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
    2. 节省时间,简捷,单个样品操作一般可在10分钟内完成。
    3. 产量高,典型的产量800µl M13丝状噬菌体上清可以提取3µg 噬菌体单链DNA。
    4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9。可以直接用来测序,一般典型可辨认读长达650bp。
 
注意事项:
    1. 所有的离心步骤均在室温完成, 使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
    2. 开始实验前将需要的水浴先预热到50℃备用。
    3. 结合液MB含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
以 800μl噬菌体感染细菌培养上清提取举例:
²        提示:第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
 
1. 将M13丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管,12,000rpm离心5分钟沉淀菌体。
 
2. 小心取800μl上清转入新的1.5ml离心管,加入400μl结合液MB,充分混匀。
如果使用的上清大于或者小于800μl,则结合液MB的用量需要按照比例增加或者减少。
 
3. 将上述混合物加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心15秒,倒掉收集管中的废液。
吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物,因此需要分次把混合物加到吸附柱内,重复步骤3。
 
4. 加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃废液。
 
5. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
6. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加60μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在50℃水浴中预热),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。如果想得到较多量的DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,10,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于40μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
 
7. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
 
附录(M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程):
    下面举例说明M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程,详细的 M13M13 噬菌体(或M13来源噬粒)培养和上清准备过程请参见『分子克隆』第二版。
 
1. 37℃振摇过夜培养合适的噬菌体宿主菌(如JM109)。
 
2. 使用6%的过夜培养菌接种新鲜的LB培养液,37℃振摇培养一个小时。
 
3. 根据M13噬菌体的储存液的浓度(滴度)按照0.5-1.5%(V/V)的比例加入噬菌体来感染宿主菌。37℃振摇培养5-6 个小时。
 
4. 将上面M13丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管,12,000rpm离心5分钟沉淀菌体。
 
5. 可选步骤:小心取1ml上清转入新的1.5ml离心管,重复步骤4离心5分钟。
这步有助于去除上清中残留的微量宿主菌RNA或者DNA。
 
6. 小心取800μl上清转入新的1.5ml离心管。
 
7. 现在可以按照操作步骤提取噬菌体单链DNA了。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议






低核酸产量或者
纯度不高
*试剂盒储存在非最佳条件-建议:收到试剂盒后总是存放在室温(15℃-20℃)
*缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下-建议:储存在室温(15℃-20℃),每次用完后立刻盖紧盖子,以免溶液蒸发,PH改变和污染
*漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇
*试剂和样品没有充分混匀-建议:加入每个试剂后都要充分混匀
*噬菌体上清滴度太低-建议:离心取噬菌体感染细菌培养物上清时离心最好不要超过5分钟,转速不要超过12,000rpm,否则噬菌体上清也可能离心下来。重新培养一次噬菌体感染细菌
*洗脱效率不高-建议:确保做了步骤5,否则残留乙醇会影响洗脱效率,仔细阅读步骤6和只使用洗脱缓冲液EB洗脱
 
DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
*忘记做步骤5,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤5,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用
纯化的DNA产物D260数值异常偏高
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数-建议:将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用