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λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒…

产品编号: CC9795

产品包装: 50次、100次

产品价格: 1500元/2500元

说明书下载
  • 产品简介
  • 使用说明
  • 产品图片

 

适用范围:适用于快速λ噬菌体DNA
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
100
RNase A
-20℃
20mg
20mg×2
DNase I
-20℃
50mg
50mg×2
噬菌体沉淀液
室温
100ml
100ml×2
裂解缓冲液
室温
30ml
60ml
杂质沉淀液
室温
5ml
10ml
结合液LB
室温
20ml
40ml
漂洗液WB
室温
15ml
25ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
10ml
15ml
吸附柱AC
室温
50个
100个
收集管(2ml)
室温
50个
100个

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
 
储存事项:
    1. 在RNase A管和DNase I管分别加入1ml的裂解缓冲液吹打,颠倒混匀,充分溶解RNase A和DNase I后, 按照每次使用量分装-20℃冻存,有效期6个月。
    2. 结合液LB低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
    3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:
    λ噬菌体载体广泛用于文库筛选,目的克隆培养获得大量的噬菌体颗粒需要提取λ噬菌体DNA来开展测序等后续工作。λ噬菌体裂解培养物离心后的上清,首先用RNase A/DNase I混合酶消化去除残留的宿主菌DNA/RNA,沉淀收集噬菌体,噬菌体被SDS裂解,残留碎片通过沉淀离心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将λ噬菌体DNA从硅基质膜上洗脱。
 
产品特点:
    1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
    2. 节省时间,简捷,可用于液体培养裂解物和固体培养板的提取,单个样品操作一般可在1.5小时内完成。
    3. 产量高,典型的产量10ml λ噬菌体裂解培养物上清可以提取约10µg λ噬菌体DNA。
    4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9。可以直接用来酶切和测序。
 
注意事项:
    1. 使用转速可以达到13,000rpm的冷冻离心机。
    2. 开始实验前将需要的水浴先预热到37℃备用。
    3. 需要自备氯仿,20%SDS。
    4. 结合液LB含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
以 1010 mlml 噬菌体感染细菌培养上清提取举例:
提示:
²        第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
²        将噬菌体沉淀液放在冰上预冷。
 
1. 将0.5%氯仿处理后的λ噬菌体感染的液体培养物10,000g(约12,000rpm)4℃离心10分钟去除细胞碎片和残渣。
转速不能过高,时间不能过长,否则噬菌体可能和碎片一起沉淀,降低产量。
 
2. 取10ml上清,加入20μl RNase和20μl DNase充分混匀37℃温育30分钟。
每个噬菌体培养上清因生长和裂解情况不同而残留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化过头,可能减少产量;消化不完全,可能未消化的DNA/RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体减低产量并/或者导致最后污染宿主菌DNA,因此应该根据实际情况适当调节用量和消化时间。
 
3. 加入2ml冰预冷的噬菌体沉淀液,轻柔充分混匀后置冰上冷却(培养板裂解物必须在冰上放置30分钟)。
 
4. 10,000g(12,000rpm)4℃离心10分钟,弃上清,干燥 1 分钟。沉淀下来的噬菌体外观为透亮或者稍白的沉淀。
 
5. 加入500μl裂解缓冲液,吹打重悬噬菌体,加入100μl 20%SDS,立即轻柔颠倒混匀4-6次后,70℃温育10 分钟,然后置冰上冷却。
 
6. 加入100μl杂质沉淀液,立即轻柔颠倒混匀4-6次,最高速13,000g 4℃离心10分钟。
 
7. 仔细将上清转入新的离心管,加入350μl结合液LB,轻柔涡旋混匀。
 
8. 将上述混合物加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液。
吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物,因此需要分次把混合物上到吸附柱内,重复步骤8。
 
9. 加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃废液。
 
10. 可选步骤:重复步骤9一遍。
 
11. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
12. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在50℃水浴中预热),室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。如果想得到较多量的DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于40μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
13. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
 
问题与解决方法:

问题
评论与建议
 
 
 
 




低核酸产量
或者纯度不高
*试剂盒储存在非最佳条件-建议:收到试剂盒后总是存放在室温(15℃-20℃)
*缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下-建议:储存在室温(15℃-20℃),每次用完后立刻盖紧盖子,以免溶液蒸发,PH改变和污染
*漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇
*试剂和样品没有充分混匀-建议:加入每个试剂后都要充分混匀
*噬菌体上清滴度太低-建议:1.确认λ噬菌体已经完全裂解了宿主菌(加入0.5%的氯仿可以帮助完全裂解);2.离心去除宿主菌碎片残渣时间不能超过10分钟,转速不超过
10,000g,否则否则噬菌体也可能和碎片一起沉淀丢失;3.重新培养一次噬菌体感染细菌
*DNase I/RNase消化不足或者过头-建议:消化过头,可能减少产量并导致最后污染宿主菌DNA;消化不完全,可能未消化的DNA,RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体,因此可以适当调节用量

宿主菌基因组
DNA残留过高
*DNase I/RNase失活或者反应条件不佳-建议:DNase I/RNase必须溶解在裂解缓冲液中,必须分装冻存。λ噬菌体必须用LM(含镁离子)培养,在其它培养肉汤中,DNase消化活性可能受到影响
加入噬菌体沉淀剂后未见到λ噬菌体沉淀
*不适合的离心温度和离心力-建议:10,000(12,000rpm)4℃离心10分钟
*上清中含λ噬菌体太少-建议:离心前,样品置冰上冷却。参见前面滴度太低解决办法
 
 
DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
*忘记做步骤11,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤10,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用
*使用了错误的培养基培养λ噬菌体-建议:λ噬菌体必须用LM(含镁离子)培养,在其它培养肉汤中,DNA酶切活性可能受到影响。培养板培养必须用琼脂糖Agarose板,如果
用琼脂Agar板,可能抑制酶切
纯化的DNA产物D260数值异常偏高
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数-建议:将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用