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口腔/咽拭子基因组DNA快速提取试…

产品编号: CC9798

产品包装: 50次

产品价格: 450/550元(带蛋白酶K)

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目录编号:CC9798
包装单位:50次
 
适用范围:适合于从口腔/咽拭子中分离纯化基因组DNA。
 
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
裂解液ML
室温
20ml
结合液CB
室温
20ml
抑制物去除液IR
室温
25ml
漂洗液WB
室温
15ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
Carrier RNA
-20℃
310ug
洗脱缓冲液EB
室温
15ml
蛋白酶K粉(可选)20mg/ml
-20℃
20mg
吸附柱AC和收集管
室温
50套

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果
 
储存事项:
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存,-20℃保存。
3. Carrier RNA收到时为冻干粉状,使用前按照注意事项4配制和储存。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
 
产品介绍:
本试剂盒采用特制的进口DNA吸附柱和独特的缓冲液系统,特别适合于从口腔/咽拭子中分离纯化基因组DNA。各种来源样品裂解消化处理后 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜(特别配备了Carrier RNA可以从体系中轻松捕获微量核酸),再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的DNA 无杂质和PCR抑制剂,可直接适用于PCR分析。
 
产品特点:
    1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
    2. 节省时间,简捷,单个样品操作一般可在 20 分钟内完成。
    3. 配备了Carrier RNA用于充分收集特别微量 DNA。
    4. 多次柱漂洗确保高纯度,提取的DNA纯度高,质量稳定可靠,可适用于各种常规操作,包括 PCR、酶切、测序、Southern杂交等。
 
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
2. 开始实验前将需要的水浴先预热到特定温度备用。
3. 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. Carrier RNA
      1) Carrier RNA收到时为冻干状,使用时加入310ul RNase free水充分溶解,配制成1ug/ul溶液。Carrier RNA溶液应避免反复冻融,冻融次数不能超过3次。所以建议在第一次使用时按自己每次的用量分装在RNase-free的离心管中后置于-20℃储存。
      2) Carrier RNA使用方法:如果起始处理量很少(口腔咽拭子上收集到的细胞很少),我们推荐使用Carrier RNA,如果预期有较大量DNA产量,用户可以根据需要选择是否加入Carrier RNA。使用时在每个样品提取所需结合液CB中加入1ul Carrier RNA储存溶液,将结合液CB与Carrier RNA溶液充分颠倒混匀即可(结合液CB容易起泡沫,请勿使用涡旋振荡混匀)。也可根据样品数量,在总共需要的结合液CB中加入总共需要的Carrier RNA混匀备用。混合液在室温24小时内稳定。
        3) Carrier RNA加入过多造成DNA洗脱液中Carrier RNA浓度过高,下游PCR反应可能受干扰,加入过少可能并不能帮助提高DNA产量和PCR敏感度,因此加入量应该在具体试验中调整以得到最佳效果。

 

操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
    提示:第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
    取样:取一根医用消毒棉签(手不要碰触脱脂棉部位),伸进口腔,紧靠脸颊内侧来回刮拭20次(不时旋转棉棒),需充分接触口腔粘膜。
    注意事项:避免用手触及棉签,采集前可先用清水轻轻漱口。为防止样本被食物或者饮料污染,取样前30分钟内应该避免进食或者饮水。
 
1. 用剪刀将棉签部分从其杆上剪下,放入2ml离心管中,加入400ul裂解液ML。
 
2. 再加入20ul的蛋白酶K(20mg/ml)溶液,立刻涡旋振荡充分混匀,56℃放置1小时,期间每10分钟涡旋混匀10秒。
 
3. 加入400ul结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,70℃放置10分钟。
如果拭子上细胞数量少,导致提取的基因组DNA产量过低,可以在400ul结合液CB中加入1ul Carrier RNA储存溶液。
 
4. 冷却后加200ul无水乙醇,立刻涡旋振荡充分混匀。简短离心以除去管盖内壁的液滴,收集所有的液体到管底。
如果周围环境高于25℃,乙醇需要冰上预冷后再加入。
 
5. 将上一步混合物加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
棉签的棉花可能还吸附一些液体,如果要提高产量,可以用干净镊子夹挤出液体后弃棉花,减少棉花上液体残留。
 
6. 加入500ul抑制物去除液IR,12,000rpm离心30秒,弃废液。
 
7. 加入500ul漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
8. 加入500ul漂洗液WB,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
 
9. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 
10. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加20-50ul洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好), 室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置 1分钟,12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于20ul,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
 
11. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
 
问题与解决方法

问题
评论与建议
 
 
 


DNA产量低或者
洗脱液中无DNA
*Carrier RNA没有加入到结合液CB-建议:仔细阅读注意事项4
*样品冻融超过1次-建议:尽量使用新鲜样品和冻融不超过1次的样品
*样品在室温放置过久-建议:尽快处理样品或者低温适当方式保存
*裂解不完全,蛋白酶K失效了-建议:收到蛋白酶K后,按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融
*结合液CB和Carrier RNA没有充分混匀-建议:充分涡旋混匀
*试剂和样品没有充分混匀-建议:加入每个试剂后都要充分混匀
*洗脱效率不高-建议:确保做了步骤9,否则残留乙醇会影响洗脱效率,仔细阅读步骤13和只使用洗脱缓冲液EB洗脱
 

DNA的下游反应
如PCR效果不佳
*DNA产量低或者洗脱液中无DNA-建议:在下游反应中增加DNA用量
*洗脱液中太多或者太少的Carrier RNA-建议:确定在下游应用中Carrier RNA的最大允许量,调整结合液CB中加入Carrier RNA的用量
*降低的灵敏度-建议:确定在下游PCR应用中DNA洗脱液的最大允许用量,减少或者增加DNA洗脱液在PCR反应中的用量,DNA洗脱体积也可以相应的调整
 
DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议:确保做了步骤9,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用