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    合肥市蜀山区槽郢路微商学院14号4栋2单元203室

分子生物学技术服务

1. 荧光定量PCR

         荧光定量PCR技术,是通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,对起始模板进行定量分析的方法。
        
1-1 定量方式
 
         1. 绝对定量:用已知浓度的标准品绘制标准曲线,而后通过标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量(起始拷贝数)分析。
         2. 相对定量:以内参基因为参照,比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化,通常用来对mRNA表达量进行分析。

1-2  检测基因分类

         1. mRNA表达量水平检测:相对定量法。
         2. MicroRNA表达量水平检测:通过设计特殊茎环结构的反转录引物,结合实时定量PCR可以精确检测微量样品中microRNA表达水平。内参基因一般用U6。 
         3. 基因拷贝数检测:如检测样品中不同细菌含量、基因工程菌目的基因拷贝数、环境中耐药基因检测等。采用绝对定量法。
  
1-3 检测方法

        1. SYBR Green Ⅰ法:
         在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
 
SYBR荧光定量原理示意图 定量PCR扩增荧光曲线图
 

PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性)
 

       2. TaqMan探针法:
        探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
 

1-4 服务流程

         1. 客户认真写好订单,提供待检基因相关信息;
         2. 签订技术服务合同,支付预付款;
         3. 设计合成定量PCR引物(或客户提供文献引物委托本公司合成);
         4. DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录;
         5. PCR预实验,主要检测引物的特异性和扩增效率;
         6. 正式定量实验:对所有样品上机检测;
         7. 实验结果和数据分析,形成报告。

1-5 收费标准 
服务项目 数量计算 单 价

引物合成

mRNA

?对(含内参)

50.00元/对

miRNA

?对(含内参)

80.00元/对

探针

?条(含内参)

1,000.00元/条

DNA提取

血样

?个样品

20.00元/样

细胞、组织等

?个样品

30.00元/样

水、泥、土样等

?个样品

30.00~50.00元/样

RNA提取+反转录

?个样品

80.00元/样

绝对定量质粒构建

?个基因

600.00元/基因

标准曲线

2重复

?个基因×5个点×2重复

30.00元/个

3重复

?个基因×5个点×3重复

30.00元/个

上机、荧光PCR

1重复

?样×?基因×1重复

30.00元/个

2重复

?样×?基因×2重复

30.00元/个

3重复

?样×?基因×3重复

30.00元/个




2. 微卫星(STR)分型服务

2-1 定义与应用  

       微卫星多态位点是一种短核苷酸串连重复多态(Short Tandom Repeat,STR),重复单元通常为2~5 bp。由于这种重复序列在DNA复制过程中不稳定,突变高,从而导致这种标记位点的多态性很强, 杂合度很高。
       由于其能提供大量的遗传标记,因此被认为是继限制性片段长度多态性(RFLP)之后的第二代遗传标记,广泛应用于遗传制图、基因定位、法医学鉴定、人类学以及遗传病的诊断等许多领域的研究。

2-2 分型原理  

       利用荧光标记的PCR引物对多个微卫星多态位点进行扩增,然后采用高分辨率胶电泳(如用于测序的毛细管电泳等),对扩增片断进行分离,通过荧光检测系统确定扩增片断的长度,实现对微卫星多态位点的分型。
       生工以ABI 3730XL测序仪为依托,依靠其专业的STR检测软件GeneMapper4.0,为您提供专业的STR检测服务。

2-3 实验流程

     
  1. 实验方案的设计,包括荧光标记的选择,引物的设计、合成和标记、内标的选用等。
       2. 预实验:确定PCR反应条件。
       3. 正式实验:完成荧光PCR,并在测序仪上完成电泳扫描,数据采集,去掉低值数据,分析结果、补充测序、完成分析。
       4. 用GeneMapper4.0软件对收集的数据进行处理分析,提供产物片段大小、数量多少的信息数据。
 

 

FAM标记 
 
 
ROX标记
HEX标记

 

                                                    生工STR图谱案例
 
 
2-4  STR检测服务价格
项 目
内 容
价 格
抽提DNA
全血样本
20.00元/样本
石蜡切片、组织样本
50.00元/样本
预实验
确定PCR反应条件,确保得到一清晰的条带
每个扩增区域200.00元
PCR反应
根据预实验结果进行大量PCR
5.00~10.00元/管(依据PCR难易度)
标记引物
荧光标记引物合成
300.00~500.00元/条
正式实验
3730XL测序仪电泳检测
1,000.00元/96反应(客户不提供标)不满96个按96个计算

 

2-5  客户提供     

         1. STR检测服务订单(可通过官方网站下载,请仔细填写)
         2. 样品及样品要求

 

样 品
要 求
PCR产物
≥20 ng/μl,10 μl
基因组DNA
≥20 ng/μl,20 μl(具体量根据实验要求做调整)
全血样本
1 ml EDTA抗凝血
石蜡切片、组织样本
>100 mg

 

 
2-6 服务周期

         4~6周(具体时间根据STR位点/样本数量而定)。
    
2-7 提交结果

         原始文件、PDF格式蜂图、Excel表格数据。 



 
3. DNA文库构建及EST测序

3-1  cDNA文库构建

        生工基于Clontech的SMART方法和独具的技术优势及严格的质量控制,确保客户得到满意的cDNA文库,可以使您获得最多的全长基因,全长率最高可达90%;结合完整的实验室构架,无缝对接3730XL测序平台可同时进行EST测序,使您更有效地节省时间,提高效率。
        十年多来,生工先后对线虫、真菌、白色念珠菌、盐藻、华支睾吸虫、油菜、水稻、棉花、大鼠、小鼠、人等数十个物种进行cDNA文库构建和Unigene测序,先后测定了数百万个序列,拥有丰富的均质化文库构建经验。
       
实验流程见图:

 

 

 

3-2 EST测序

        ESTs即表达序列标签(expressedsequence tags, ESTs),短的、单次(测序)阅读的cDNA序列,也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。对构建好的文库进行测序,同时可以获得ESTs信息分析服务。
W4-2-1 EST测序的应用
     1.基因的表达谱分析;
     2.从EST中可以发掘SSR标记;
     3. EST可以作为构建分子标记连锁图谱所用的探针。
         W4-2-1EST服务内容ESTs信息分析服务又分为基本信息分析服务和高级信息分析服务。

具体分析流程见图:
 
 

3-3 服务报价及服务须知

项 目 内 容 价 格
Smart cDNA文库 cDNA文库构建 15,000.00元(赠20个测序)
均一化cDNA文库 全长cDNA文库构建 25,000.00元(赠50个测序)
EST测序 <5,000条 25.00元
5,000-10,000条 22.00元
>10,000条 询价
基础信息服务 免费
高级信息服务 询价
送样要求 提供保质保量的组织(5 g)、细胞株(2×107细胞)、总RNA>20 μg
实验周期 4~6周

 
3-4 实验内容及提供结果

 实验内容
 提供的结果及材料
 
 第一阶段
 
 1. 提取总RNA,分离、纯化总mRNA后,进行反转录合成cDNA第一链。
 2. 通过引物延伸或LD-PCR法进行dscDNA合成,经SfiI酶切后,经层析柱分离cDNA(回收大于500 bp的cDNA)。
 3. 将分级纯化的dscDNA与SfiI酶切的逆转录病毒载体pRetro-Lib(Amp抗性)连接。
 4. 将重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞。
 
 1. 高质量的起始RNA变性电泳图。
 2. dscDNA电泳图和 pRetro-LibSfiI酶切图。
 3. 转化大肠杆菌生长的重组克隆(即原始库)培养皿照片。
 4. 详细的研究结果和分析。
 
 第二阶段
 
 1. 甘油保存大肠杆菌文库。
 2. 初级cDNA文库的QC。
(1)不同稀释度测定平均滴度,检测库容量(重组子克隆数目)。
(2)随机挑取40个克隆子,PCR方法或SfiI酶切检测重组克隆子比例(重组率),检测平均插入片段大小。
(3)每个文库随机挑取20个克隆子抽提质粒进行双向测序,通过序列分析判断插入片段是否含有全长ORF。
 3. 文库验收标准:
     库容量: >1×107 cfu/ml 平均插入片段: >1.2 kb 重组率:>95% 全长基因比例:>65%
 
 
1. 不同稀释度生长的重组克隆培养皿照片和平均滴度计算过程 。
 2. 构建好的初始cDNA文库的菌液(含甘油)5 ml,分装0.5 ml/管(冻存-80°C)。
 3. 40个克隆子的PCR鉴定电泳图(含marker标注)和插入片段长度数据。
 4. 20个随机克隆子的双向测序报告纸制版(含测序引物序列和所在载体位置)和分析 。
 5. 文库的评价,包括库容量、插入片段平均长度、重组效率、cDNA 完整性评价。
 


 
4. Infinium技术原理

       Illumina全基因组分型芯片采用Infinium技术,检测中采用全基因组扩增方式,无需PCR反应,不依赖限制性内切酶,SNP位点可以完全根据基因组情况来选择;gDNA样品在芯片杂交后通过等位基因特异性的单碱基延伸来完成,确保高质量的实验数据。
      Illumina Infinium基因分型技术包括全基因组SNP芯片和iSelect自定义全基因组SNP芯片。

   4-1-1 Infinium技术优势

      1. 独特的位点选择和设计:优先采用全世界公认的HapMap数据库中已经公布的TagSNP设计,具有更好的统计能力,可使研究者用尽可能少的样本发现SNP与疾病的相关性。 
      2. 超高通量的密度:可检测30万~120万个SNP位点。 
      3. 高基因组覆盖率:Illumina创新的Infinium HD技术能够选择任何SNP或探针,实现了基因组的密集均一覆盖,且能够靶定任何基因组区域。 
      4. 完整的SNP和CNV分析方案:Illumina的GenomeStudio分析软件包提供了完整的拷贝数工具和Genome Viewer。 
      5. 灵敏的CNV检测探针:通过内置的标记物冗余降低拷贝数测量的整体噪音。 
      6. 芯片形式灵活多样:通过在SNP位点通量和样本通量间取舍,可同时检测2、4或12个样本,增加样品通量。 
      7. 应用广泛:Genotyping平台被大量用于肿瘤、心血管疾病、精神疾病、各种免疫性疾病等复杂疾病的研究,药物遗传学研究及病禽畜的育种研究。
 
4-2 全基因组SNP分型芯片

      4-2-1 Human Omni 5-Quad (new)
     

The BeadChip delivers the most comprehensive coverage of the genome, leveraging powerful tagSNPs selected from the International HapMap and 1000 Genomes Projects that target genetic variation down to 1% minor allele frequency. Omni 5 provides the flexibility to add up to 500K custom markers, allowing researchers to tailor the BeadChip for targeted applications and population-specific studies. Using the proven HiScan or iScan system, this four-sample BeadChip offers high-throughput sample processing, and optimized content for whole-genome genotyping and CNV applications.

 
4-2-2 OmniZhongHua-8

        专门针对中国人的SNP芯片。这款芯片特别地覆盖了在中国人群体中发现的常有和稀有变异,适用于全基因组关联研究(GWAS)。经优化的90万个标签SNP信息来自HapMap所有三个阶段及千人基因组计划(1kGP),并经策略性选择,可用于在中国人种群中探索全新的疾病和性状关联。OmniZhongHua-8分析采用Illumina专利的BeadArray™技术,可提供非常高的数据质量,平均检出率> 99%,重复率>99.9%,高信噪比以及整体低噪音水平可实现精确、可靠的检出和拷贝数分析。OmniZhongHua-8覆盖了中国人群中约81%的常见变异(r2>0.8)(参照1kGP数据库),MAF≥5%;在HapMap中的覆盖度高达95%;覆盖了中国人群中约60%的稀有变异(r2>0.8)(参照1kGP数据库),MAF≥2.5%;指标比竞争对手高7%以上,由此表明该芯片是中国人群GWAS及CNV研究理想的起点,其价格也极具吸引力。
 
4-2-3 Human Omni1-Quad

          芯片数据来自人类基因组计划测序结果,其中包含了超过114万个探针信息,可以在一张芯片上平行进行4个样本的检测,该芯片包含针对基因SNPs、标签SNPs、拷贝数变化(CNV)及其它基因组区域设计的探针。该芯片所覆盖有18,000个SNPs,涵盖了GWAS研究得到的与人类疾病相关的主要区域,50,000个非同义SNPs,62,000个SNPs涵盖了100个插入缺失周边区域。
 
4-2-4 HumancytoSNP-12

         该芯片包括了近30万个遗传标记,能鉴别包括智力缺陷、自闭症、Prader-Willi综合症、Angelman症等300多种综合症在内的染色体的缺失、重复,单亲二倍体(UPD)等细胞遗传异常。与FISH、array-CGH或其他染色体分型技术不同,该芯片能快速低成本地筛选与疾病相关的SNP,分析结构变异,并鉴定杂合子丢失如UPD,是目前array-CGH产品所检测不到的。该芯片是Illumina完整细胞遗传学解决方案的一部分。
 
4-2-5牛全基因组SNP分型芯片

         该芯片含超过54,000个靶SNP探针,SNP信息来自Illumina GenomeAnalzyer测序结果和已发布的公共信息。该芯片可分析12个样本,是分析牛基因变异的经济有效的实验手段。牛SNP50基因芯片SNP位点的平均间隔为51.5 kb,相较于全基因组扫描、鉴定数量性状位点、比较遗传学等其他试验方法,该方法的探针密度更高,分析更有效。 8-2-6犬全基因组SNP分型芯片该芯片含有大量信息的SNP探针,平均间隔为22,362 bp,可以对任何一种家养犬类进行全基因组扫描。Illumina公司通过与CanFam2.0合作,挑选出高多态性位点以鉴定不同的家养犬类种群。如果SNP平均密度为每兆8个位点,那么该芯片可包含所有的种群关联研究位点。该芯片可同时检验12个样本,大大节约了经费。
 
4-2-7马全基因组SNP分型芯片

          该芯片含54,602个SNP位点,这些位点均一分布在15个品种马匹的全基因组序列上,芯片数据信息来自马基因组测序计划,马SNP50基因芯片SNP的平均间隔为43.2 kb。该基因芯片可同时检测12个样本,为各种全基因组研究提供了可能,例如基因关联研究和鉴定数量性状位点的研究。 8-2-8猪全基因组SNP分型芯片它包含超过60,000个SNP位点,以步长平均每40 kb有一个标记,覆盖猪的基因组。此12样本芯片整合了多种猪的基因差异,包括杜洛克猪、长白猪、皮特兰猪和大白猪,其性价比高,能提供足够的SNP密度,可应用与全基因组关联研究或其他研究中,如全基因组选择、测定遗传指数、鉴定数量性状位点、比较基因研究。

4-2-9羊全基因组SNP分型芯片

         该芯片包含超过50,000个SNP位点,平均每46 kb有一个标记,覆盖整个基因组。此12样本芯片整合了多个羊品种基因差异,能提供足够的SNP密度,可应用与全基因组关联研究或其他研究中。
 
4-2-10玉米基因组SNP分型芯片

         该芯片包含56,110个SNP探针,信息来源玉米B73系基因组序列,每张芯片可同时检测24个样本。
 
4-3针对性及自定义SNP分型芯片  
 
     4-3-1心血管SNP芯片(HumanCVD BeadChip)

        包含48,742个SNP探针,可检测2,100余个与心血管疾病(CVD)相关候选基因。探针来源:已发表科研文献、心血管疾病(CVD)通路分析以及最新全基因组关联分析的资料。
 
     4-3-2肿瘤相关SNP芯片(Cancer Panel)

   
      选择约400个肿瘤相关基因的>1,400个SNP标记,信息来源于美国NIHSNP500肿瘤数据库
http://snp500cancer.nci.nih.gov/
 
     4-3-3主要组织兼容性研究芯片(MHC Panel)MHC(MajorHistocompatibility Complex)

         主要组织相容性区域是一段4 Mb的基因组序列,位于Chr 6p21上,包含了160个基因。这些基因中有40%与免疫蛋白编码相关,其中也包括了白细胞抗原基因等。MHC芯片针对这一区域挑选了2,400个平均间隔2 kb的SNP标记,对该区域的SNP进行检测。MHC芯片可广泛应用于免疫、移植、疾病等相关研究。
 
     4-3-4自定义Goldengate CustomPanels

        Illumina专利的GoldenGate™是以应用为导向的自定义型SNP分型技术。用户可以根据研究需要挑选SNP位点,制作探针组(OPA)来进行分型研究。它适用于多种研究,如各种疾病的连锁分析或关联分析;个体化医疗药物遗传学研究;禽畜的育种分型;其他物种(如微生物,植物等)的遗传学研究等等。一个样品可以同时进行96,384,768,1536个SNP位点的研究,满足不同研究对低、中、高不同通量的要求。
 
     4-3-5自定义Iselect CustomPanels

        完全根据研究需要挑选SNP位点进行研究。每张芯片可平行做12个样品,每个样品可检测7,600 ~ 60,800个SNP位点。
 
4-4连锁分析芯片

     4-4-1人类连锁分析芯片(HumanLinkage-12)

         包括了人全基因组内染色体区域内的>6,000个SNP标记,均是从HapMap项目数据库中挑选出来的信息结果最好的标记,两个SNP平均遗传间距0.64 cm,物理间距482 Kb,比STR具有更高的密度。连锁分析芯片是进行疾病连锁分析的最佳工具,可以从家系基因型表现型和单基因型连锁不平衡中发现连锁关系。每张芯片可平行做12个样品,每个样品可检测6,090个SNP位点。8-4-2小鼠低密度和中密度连锁分析芯片小鼠低密度和中密度连锁分析芯片提供了两套不同密度的芯片进行疾病的连锁分析。
       1.小鼠低密度连锁分析芯片(Mouse Low Density (MD) Linkage Panel):包括了377个位点,适用于N2和F2代遗传杂交的小鼠。可用于进行QTL(quantitative trait loci)图谱定位。
       2.鼠中密度连锁分析芯片(Mouse Medium Density (MD) Linkage Panel):包括了1,449个位点,适用于绘制转基因动物、同类品系、基因敲除的动物和互交品系的遗传图谱。
          有两种芯片格式可选:Sentrix Universal BeadChip,每Chip可同时检测16个样本;或Sentrix Universal Array Matrix,每Matrix可同时检测96个样本。
 
4-5甲基化研究芯片

        4-5-1人类全基因组甲基化芯片(Human Methylation27)

        借助于Illumina的Infinium技术方案,使用户对每一个样本均可检测到>27,000个CpG位点。该芯片中的CpG信息涵盖了>14,000个已在NCBI的CCDS数据库中描述注释的基因,芯片上的150个已经确认的癌症基因,以不同的甲基化形式存在。补充的1,000个癌症相关的基因都有相关的文献报道。有200个CpG位点存在于CpG岛上,分布于miRNA启动子区域。每张芯片可平行做12个样品,每个样本可同时检测27,000 CpG位点。8-5-2 GoldenGate甲基化肿瘤芯片(Methylation Cancer Panel I)包含了807个肿瘤相关基因的1,505CpG岛。包括:
1. tumorsuppressor genes
2.oncogenes
3. genesinvolved in DNA repair
4. cellcycle control
5.differentiation
6. apoptosis
7. X-linked8. imprintedgenes
 
 
     4-5-1人类humanHT-12全基因组表达谱微珠芯片

      每张芯片可同时检测12个样本,每样本分析超过48,000个转录本,基因信息来自于NCBI RefSeq database(Build 36.2, Release 22)以及Unigene database(Build199)。
 
     4-5-2小鼠MouseWG-6 v2.0全基因组表达谱微珠芯片

      每张芯片可同时检测6个样本,每样本分析超过45,200个转录本,基因信息来自于NCBI RefSeq database(Build 36, Release 22)、RIKEN FANTOM2 database、RefSeq Release 5(Build 33.1)以及MEEBO(Mouse Exonic Evidence Based Oligonucleotide)。 
 
   4-5-3 GoldenGate自定义甲基化芯片(Custom Methylation Panels)

       
研究人员向Illumina提供以下信息中的任何一种,Illumina可帮助选择CpG位点,制成甲基化研究芯片,每panel可平行检测96个样本,每个样品可同时检测384~1536个甲基化位点。
1. NCBI's GeneID
2. Gene symbol (HUGO & RefSeq)
3. RefSeq mRNA accession number with or without versionnumber
4. RefSeq mRNA GI number
5. Chromosomal region (RefSeq build, chromosome, pair ofcoordinates)
6. Sequence
 
4-6 全基因组表达谱微珠芯片

     
   全基因组表达谱芯片可以广泛地应用于高置信度靶位点发掘、疾病分子分型和分子通路分析等研究领域上。研究人员现在可以在一张芯片上获取多个样本的全基因组表达谱。其特点如下:
 
1. 50碱基的全长探针提供更可靠的特异性和敏感度;
2. 更高密度的芯片降低样本使用量;
3. 冗余度设计(每个点重复30倍)提供更准确的数据;
4. 超低的价格提供更大规模实验可能。
 
4-7 Illumina光纤微珠芯片服务价格
 
种 类 类 型
位点数
价 格(元/样) 样本数 / 张芯片
人基因组 SNP 分型芯片 Human Omni5-Quad (new) 500万

12,000

4 个样本

Human Omni2.5-8 250万

8,000

8 个样本

Human Omni1-Quad 114万

5,500

4 个样本

Human OmniZhongHua-8 (new) 90万

4,500

8 个样本

Human OmniExpress-12 70万

4,000

12 个样本

Human CytoSNP-12 30万

3,500.00

12 个样本

Human Exome-12(new) 25万

2,200.00

12 个样本

Human Linkage-24 6056

3,200.00

24个样本

动物植物基因组 SNP 分型芯片 牛 HD芯片 70万

4,800.00

8个样本

牛 SNP50芯片 5万

4,000.00

24个样本

牛 LD连锁芯片 6000

2,200.00

24个样本

犬HD芯片 17万

4,800.00

12个样本

羊SNP50芯片 5万

4,000.00

12个样本

马SNP50芯片 5万

4,000.00

12个样本

猪SNP60芯片 6万

4,000.00

12个样本

玉米SNP50芯片 5万

4,000.00

24个样本

甲基化检测芯片 Human Methylation 27K 27,578

5,000.00

12个样本
Human Methylation 450K 48万

6,800.00

12个样本
表达谱芯片 HumanHT-12 V4 47,231

3,800.00

12个样本
MouseWG-6 45,281

4,200.00

6个样本

定制SNP 芯片(以480 样以上)

位点数 96个 144个 192个 384个 768个

1,152个

1536个
价格(元) 15万 18万 24万 42万 55万 75万 80万

定制甲基化芯片(以 480 样以上)

位点数

96个甲基化位点

384个甲基化位点

其它

价格(元)

25万元

60万元

询价





5. 基因甲基化(Methylation) 位点检测服务

        DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分,是最具特点的表观遗传学修饰。在人的正常发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病(如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等)发生过程中发挥重要作用。DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。哺乳动物中,CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%,但在基因组的某些区域中,通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区,CpG序列密度很高,可以达均值的5倍以上,成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区,形成所谓的CpG岛,只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。


 

服务内容
 
1 亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP):此方法可靠性及精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。
 
甲基化服务流程

操作流程:

  • 样品用本公司试剂盒进行基因组DNA提取。
  • 重亚硫酸盐处理(包括纯化和脱磺基反应)使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。
  • 用甲基化引物设计相关软件在甲基化区域两端设计引物。
  • 进行基因扩增及PCR产物回收。
  •  PCR产物直接测序或克隆测序(定量分析),分析每个CpG岛甲基化情况。  

实验实例:
 
 
5个克隆测序结果图(甲基化程度38/45=84.4%)
 
2  甲基化特异性的PCR法 

     MSP法(Methylation-Specific PCR)是Herman等(1996)在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高,主要用于作定性研究。
 
     操作流程:

 

  • 样品用本公司试剂盒进行基因组DNA提取。
  • 重亚硫酸盐处理(包括纯化和脱磺基反应)。
  • 用甲基化引物设计相关软件在甲基化区域设计甲基化特异性的引物(primerⅠ)或非甲基化的引物(primerⅡ)引物2对。
  • 进行特异性的PCR扩增,只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。
  • 检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化。


实验实例:

 
   

3  结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法

    Xiong and Peter(1997)报道了Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)甲基化检测法。这种方法对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增,随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。重亚硫酸盐处理DNA后行PCR扩增,用限制性内切酶识别转化后序列中的酶切位点(可以通过引入酶切位点的方法实行对所有甲基化位点的进行酶切鉴定),消化产物电泳分离,与完全非甲基化阴性对照组比较,得出序列中特异位点甲基化水平。

 

操作流程:

  • DNA亚硫酸盐处理(包括纯化和脱磺基反应)使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。
  • 用甲基化引物设计相关软件进行引物设计和选用适合的内切酶。
  • 进行PCR扩增预实验及正式实验。
  • PCR产物直接酶切及电泳检测。

    实验实例:

    某客户提供的基因序列经亚硫酸氢钠修饰后模式序列:
    GAGTGAGTGTTAAAAGTTGGAGTTTAGTAGAATTATAGTGATGTTTTTATTTCGGGTAAATGTTTAATTATATTTTTTTTTGTAAAAATAACGGTGTTATTAAATATGGATYGGTTGTTTTATGAGTTTATTTTTAGGAAATAGTGGTTGAGTAGTAGAAGTTTGATC
     
    引物设计:
    F: 5'  GAGTGTTAAAAGTTGGAGTTTAGTAG  3'   TM=54.2
    R: 5'  CTTCTACTACTCAACCACTATTTCC  3'     TM=54.2  
     
    引物设计说明:PCR产物为157bp,检测位点是Y(C/T)。
    酶切用酶:Bsp143l  ^GATC   [生工产品编号:BER0781]
     
    酶切现象:
    T/T:不能酶切,产物1条157bp带 -----------------------------------该位点基因组无甲基化
    C/C:能酶切,产物2条分别为106bp,51bp带 --------------------该位点基因组完全甲基化 
    C/T:部分能酶切,产物3条分别为157bp,106bp,51bp带 ---该位点部分基因组甲基化

    4. 高分辨率熔解曲线(HRM)技术服务 

    5 焦磷酸测序法
     
           焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是由4种酶(DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase))催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对,则会在DNA聚合酶的作用下,添加到测序引物的3'末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技术,通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。
     
    操作流程:

    • DNA亚硫酸盐处理
    • 用焦磷酸测序专门引物设计软件设计甲基化引物
    • 进行PCR扩增预实验及正式实验
    • PCR产物上焦磷酸测序仪检测 

    实验实例如下:

     
    6  Infinium甲基化芯片检测

           Ⅰ Human Methylation 450K BeadChip,450K芯片可检测人全基因组48万个甲基化位点,广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他疾病研究,是唯一一款适合EWAS(表观基因组全关联分析)研究的全基因组DNA甲基化芯片。每张芯片多达900万个点(9M),以极高的密度覆盖了99%的RefSeq基因和96%的CpG岛,包括启动子区、5’UTR区、第一外显子区、gene body区、3’UTR区、基因间区域以及CpG岛外低密度分布的CpG位点。此外该芯片还额外添加了一些高价值的信息,如:已经鉴定的在不同类型的肿瘤组织相对于其正常组织有差异的甲基化位点;人干细胞中已经鉴定的非CpG的甲基化位点(如CpA,CpT);通过GWAS研究鉴定出的与疾病相关的区域;miRNA基因的启动子区;编码区外的CpG岛;FANTOM 4启动子区;DNase酶高敏感的位点;450K全基因组甲基化芯片每个探针都有15-25倍重复,所以芯片重复性高达98%以上,和全基因组甲基化Bisulfite测序的相关性R2=0.96,探针假阳性率低于1%。每个样本只需要500ng的基因组DNA,适用于石蜡包埋组织和福尔马林保存样本。
            Ⅱ  GoldenGate定制甲基化芯片 研究人员向Illumina提供任意96个位点和384个位点的定制甲基化芯片,不受物种限制,适用于大样本量研究。
     
    芯片特点:

    1. 单碱基检测:illumna甲基化芯片采用创新的单碱基(Infinium)检测技术,专门针对每个CpG位点设计探针,在单个CpG位点水平上提供定量的甲基化数据,可直接检测到发生甲基化程度差异的准确位点,而非发生甲基化差异的区段。是市面上唯一一种可以检测单CpG分辨率的全基因组甲基化芯片。(其它厂家的甲基化芯片都只能检测到甲基化位点高富集的区段,而不能检测到单个CpG位点) 。

    2. 超高密度:illumna全基因组DNA甲基化芯片可检测人基因组45万个甲基化位
    点,每张芯片共2700万个探针覆盖所有的NCBI注释的基因,包括启动子,3’区和5’区,是目前基因组分布密度最高的甲基化芯片。

    3. 不依赖Me-DIP:采用illumna革命性的单碱基(Infinium)检测技术,将基因组DNA通过重亚硫酸盐处理后,检测全基因组上单个甲基化位点的甲基化程度。该技术不需要做Me-DIP(甲基化DNA免疫共沉淀)。甲基化位点覆盖整个基因组,包括甲基化位点低富集区域和甲基化位点中、高富集区域,不存在区域偏向性。从而避免了甲基化位点低富集区域在Me-DIP过程中被遗漏导致的假阴性以及在Me-DIP过程中产生的假阳性。

    4. 高重复性:每张芯片中每种探针都有30个同样的“点”分布在芯片的不同区域(探针30倍的重复),相当于每个样本重复做30张芯片,充分保证了芯片的极高重复性。实验表明illumina DNA甲基化芯片的重复性高达99%以上。

    5. 高准确率:采用单碱基延伸原理,针对每个甲基化位点设计两种探针(甲基化探针和非甲基化探针)来检测,重亚硫酸盐处理后的gDNA与每种探针互补杂交,通过识别“C”和“T”完成探针的末位延伸以及甲基化的判定,甲基化程度通过比对两种探针(甲基化探针和非甲基化探针)的荧光信号强度来计算。使用该技术可以准确的检测基因组上任何类型的甲基化位点,包括CpG位点及非CpG的甲基化位点(如CA,CT)。

    6. 低上样量:每个样本只需要500ng的基因组DNA,适用于石蜡包埋组织和福尔马林保存样本。

    7. 定制灵活:可以针对任意物种灵活定制甲基化芯片,每张芯片最多可包含1536个甲基化位点。

    8. 高性价比:illumna甲基化芯片是市面上唯一一种可以检测单碱基分辨率的超高密度全基因组甲基化芯片,因该芯片不需要做烦琐的Me-DIP,从而大大减少了实验的时间和成本,是目前市面上性价比最高的全基因组DNA甲基化芯片。
     
    二、各种方案比较
     
    检测方法 检测基因位置 定量情况 位点信息
    亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP) ≤350bp 精确,但要大量克隆测序。 精确了解每一位点甲基化程度
    甲基化特异性的PCR法(MSP) 引物设计位置 只能定性、定量不精确 待测位点甲基化程度不能了解
    结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA) 单CG位点 只能定性、定量不精确 待测位点甲基化程度大致了解
    高分辨率熔解曲线法(HRM) ≤200bp 精确检测待测片段甲基化程度 待测每一位点甲基化程度不能了解
    焦磷酸测序法(Pyrosequencing) ≤60bp 精确检测待测片段甲基化程度 精确了解每一位点甲基化程度
    甲基化芯片 全基因组 全基因组甲基化程度 精确了解芯片设计位点甲基化程度


    服务


     三、服务说明
     
    ① 样品要求:
    • 血液样品:样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝,样品量大于0.5 ml,样品采集后于-20℃或-80℃保存,低温(≤-4℃)运输。
    •  组织样品:样品可以为新鲜组织(最好-80℃保存)或石蜡包埋的组织,也可以是95%乙醇中固定的组织,组织量大于100 mg。
    •  DNA样品:纯度OD260/280 比值为 1.8-1.9,浓度≥50ng/ul,体积≥50ul。

    ② 提供详细的基因信息
          BSP方法要求待测序列≤300bp,HRM待测序列≤200bp,HRM待测序列≤200bp,焦磷酸测序待测序列≤60bp,且上下游保留200bp用于引物设计;MSP和COBRA方法要求提供待测序列的CG侯选位点。我们会根据客户的基因序列信息选择不同的检测方法,并在方案实验过程中随时与客户沟通。
     
    ③ 提供结果  
         实验报告(实验步骤,包括BSP法的5个克隆统计结果等)、PCR电泳照片、测序彩色波形图、HRM标准曲线图、焦磷酸测序原始文件、基因芯片的原始文件等。

    ④ 收费标准及周期
     
    服务内容 数量 单价 交货期限 数量
    亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP) ≤50个 700元/样本/基因(5个克隆) 15~20个工作日 >50个 协商
    1000元/样本/基因(10个克隆) 20~25个工作日 >50个 协商
    甲基化特异性的PCR法(MSP) ≤100个 300元/样本/基因 10~20个工作日 >100个 协商
    结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA) ≤100个 300元/样本/位点 15~20个工作日 >100个 协商
    高分辨率熔解曲线法(HRM) ≤200个 280元/样本/基因 15~20个工作日 >200个 协商
    焦磷酸测序法(Pyrosequencing) ≤200个 450元/样本/基因 15~20个工作日 >200个 协商
     
    甲基化检测芯片

     

    芯片种类
    位点信息量
    单价(元/样)
    样本数/芯片
    周期
    Human Methylation 450K
    48万
    6,800
    12个样本
    4周
    定制甲基化芯片
    96个甲基化位点
    根据样品量询价
    15周
    384个甲基化位点
    根据样品量询价
    20周




 

6.siRNA实验服务
 
      6-1 RNA干扰原理

       RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,是将与内源mRNA 编码区同源的小片段(19~23 bp)外源双链 RNA(siRNA)导入细胞中,引发细胞中相应mRNA 高效特异性降解,从而导致特定基因表达沉默(knock down)的一种实验技术。其中通过构建载体表达siRNA是多种siRNA制备方法中唯一有可能进行长期基因沉默研究的方法,siRNA载体可以在细胞内直接转录出shRNA,其干扰效果等同于siRNA,而且能够解决siRNA干扰时间短的缺点。
 
6-2 服务内容
 
     6-2-1 载体介导的RNAi服务

     生工使用的是新一代shRNA表达质粒,该载体在细胞内可以持续产生shRNAs,持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。siRNA表达载体带有抗生素标记,具有两种形式的克隆酶切位点(BamHⅠ和BbsⅠ)和多种筛选标记可帮助建立稳定转染细胞系。主要有6种载体,分别为pSGU6/Neo、pSGH1/Neo、pSGU6/Hygro、pSGH1/Hygro、pSGU6/GFP/Neo、pSGH1/GFP/Neo,GFP报告基因可以帮助评价转染效率和指示RNAi发生位点。

序号 载体 启动子 报告基因 抗性标记
1 pSGH1/Neo H1 / Neomycin(新霉素)
2 pSGU6/Neo U6 / Neomycin(新霉素)
3 pSGH1/Hygro H1 / Hygromycin(潮霉素)
4 pSGU6/Hygro U6 / Hygromycin(潮霉素)
5 pSGH1/GFP/Neo H1 GFP Neomycin(新霉素)
6 pSGU6/GFP/Neo U6 GFP Neomycin(新霉素)

     
操作流程:

 

1. 选择siRNA表达载体:客户需要与我们共同讨论实验方案,选择载体或客户自已提供载体。
2. shRNA设计:客户提供靶基因名称、序列或GeneBank ID ID等 。根据客户提交的目的mRNA序列,设计4~5条RNA干扰靶序列,靶序列一般为19~21 nt 长。对于每条选定的siRNA 靶序列,设计 siRNA 正义链和反义链,以 loop(9nt or 10nt)相连,形成稳定的发卡RNA,称为 shRNA(short hairpin RNA)。 

3. 载体构建:合成每条编码 shRNA的DNA 模板,并连接到 siRNA 载体,连接产物转化到DH5α大肠杆菌中。抽提阳性克隆质粒,用试剂盒抽提阳性克隆载体并定量。
4. 转染细胞:质粒直接转染细胞(客户自备细胞系),并对转染细胞进行阳性鉴定和转代细胞株的培养。

5. 干扰效果检测:
(1)基因水平上检测:提取RNA、反转录、Real-time PCR检测干扰效果。
(2)蛋白水平上检测:Western Blot检测蛋白水平干扰效果(客户自备一抗或于生工购买)。


     6-2-2 慢病毒介导的RNAi服务


           生工使用载体详见慢病毒包装服务。

 

1. 选择siRNA表达载体:客户需要与我们共同讨论实验方案,选择载体或客户自已提供载体。
2. shRNA设计:客户提供靶基因名称、序列或GeneBank ID ID等。根据客户提交的目的mRNA序列,利用高效的设计软件,设计4-5条RNA干扰靶序列,靶序列一般为19-21nt 长。对于每条选定的siRNA 靶序列,设计siRNA正义链和反义链,以loop(9nt or 10nt)相连,形成稳定的发卡RNA,称为shRNA(short hairpin RNA)。 
3. 载体构建:合成每条编码 shRNA的DNA 模板,并连接到siRNA载体,连接产物转化到DH5α大肠杆菌中。抽提阳性克隆质粒,分析测序结果。
4. 高纯质粒提取:对于测序正确的重组质粒,提取和纯化高质量的不含内毒素的siRNA病毒穿梭质粒。
5. 慢病毒包装及侵染细胞(客户自备细胞系),通过实时荧光定量PCR和Western Blot的方法分析目的基因,筛选出一条最有效的siRNA序列。
6. 筛选出的高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T细胞,进行病毒包装和生产、收集病毒液、浓缩、纯化病毒液、测定滴度。
 
6-3  服务周期及价格

服务内容 数量 提供的材料 价格(元) 周期
载体构建 目的基因的shRNA载体 1 构建报告 1,000 1~2周
目的基因的shRNA载体套餐 5 构建报告(4个目的+1个阴性对照) 4,000 2~3周
有效siRNA慢病毒筛选 细胞购买、复苏与培养 1 细胞状态图片 500 2个工作日
慢病毒侵染实验 1 侵染效率图片及分析 500 3个工作日
shRNA设计 3 靶点信息 免费 1个工作日
shRNA载体构建 4 载体构建报告 4,000 2~3周
慢病毒包装(10e8TU/ml) 5 病毒液及滴度检测报告 8,000 2~3周
慢病毒侵染(干扰筛选) 4 相关图片 2,000 1~2周
qRT-PCR引物设计及验证 2 引物序列(含内参) 200 1周
qRT-PCR检测 3*5 实验数据与分析 1,800 1~2周
Western Blot检测 5 实验数据与分析(客户提供一抗) 2000.00 1~2周
总价 / / 21,000 7~10 周
建立稳定筛选细胞系 有效siRNA慢病毒重复侵染(阳性+阴性) 2 相关图片 1,600 1~2周
稳定细胞株建立扩增(阳性+阴性) 2 细胞图片 2,000 3~4周
qRT-PCR检测 3*2 实验数据与分析 1,200 1~2周
Western Blot检测 3*2 实验数据与分析(客户提供一抗) 1,200 1~2周
提供侵染细胞(25T培养瓶,阳性(2种)+阴性,各一瓶)   细胞及照片 2,000 1~2周
总价 / / 8,000 6~9周


6-4 服务说明

 

1. siRNA服务需客户与我们共同讨论实验方案,并提供靶基因名称、序列或GeneBank ID及希望插入载体的名称等,我们将免费为您设计siRNA序列。
2. 由于构建的siRNA表达载体中插入的片段可以形成hairpin结构,因此可能会影响测序。如果质粒测序结果不理想时,我们将对由质粒扩增得到的PCR产物进行测序。
3. 开始实验时公司和客户签订详细的实验技术服务合同、保密合同,客户需预付合同金额的50%作为预付款。

6-5 提供结果

载体信息;

实验报告,包括:siRNA序列、构建载体的测序报告、荧光定量PCR检测报告、Western Blot图片及全部实验数据和详细的实验步骤。


-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

全基因合成及相关服务

1 
化学合成基因

        基因的研究是生命科学的一大基石。获得基因的途径有两个,其一是直接从生物体的核酸(基因组DNA或mRNA)钓取,其二是通过人工化学合成获得。但人工合成基因法有其独特的优点:①合成周期短,可以保证序列的100%正确无误。②当将真核基因克隆在原核生物中表达时,需将真核生物偏爱的密码子改为原核生物偏爱的密码子,才能实现高效表达,解决这一问题最好的办法是根据相应细胞的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化,之后人工合成基因;③当只知某一蛋白或多肽的氨基酸序列而不知其核苷酸序列时,最好的办法也是通过人工合成基因进行克隆和表达。④可根据需要进行基因的定点突变以改造基因。⑤研究人员根据自己的意愿设计得到自然界中很难获得甚至不存在的基因。因此,化学合成基因很有可能取代从生物体中钓取目的基因的原始方法。我公司可以根据您的任何需要化学合成相应的基因序列。

1.  基因设计: 根据您可以提供的原始信息,专业人员可以以如下方式为您提供国际一流的专业服务:
(1)当您提供最终的DNA序列时,我们的专业人员将根据您的要求对您提供的序列进行专业的分析,为您提供相关的基因结构、克隆、表达等方面的有效咨询服务。
(2)根据您提出的具体要求,由我们的专业人员为您提供免费基因设计服务。最终序列经您确认后可作为基因合成的基本信息。
(3)上海生工提供的免费基因设计服务包括完整的基因设计方案制定、密码子优化和克隆方案的制定等。

2.  我公司用于基因合成的标准载体为pUC系列和pBlueScript系列。除此以外的其它任何载体均视为您的载体。

3.  如果您需要使用上述标准载体以外的载体,则该载体应由您提供,并在结算时按克隆难易程度收取500-1000元的亚克隆费用。

4.  本公司与您在达成一致意见后,签订基因合成服务协议和保密合同,您交纳相应预付款。预付款到帐即为基因合成开始期限。

收费标准:(保证国内最低价)

基因全长(bp
>交货期限(工作日)
价格(元/bp
≤ 150bp
7 个工作日左右
600.00元/基因
150-2000bp
10-14 个工作日左右
3.8元/ bp
2000-4000bp
15-20个工作日起
询价
> 4000bp
协商
询价
特殊序列
协商
协商

(1) 若订货量较大,价格从优;
(2) 服务协议签订之后,您不得随意更改基因序列;
(3) 若需克隆到您的载体,每次亚克隆需增加五个工作日

 
6. 向您提供的技术资料和产品包括:
(1) 不少于1ug的含目的基因的通用载体质粒一份。
(2) 含上述质粒的菌株一份;
(3) 基因序列100%正确的原始测序报告正本电子版一份;
(4) 基因合成报告单一份。

7. 服务特色:
(1) 基因合成经验丰富,已完成合成的基因近100,000条;
(2) 交货迅速,严格执行服务协议条款;
(3) 服务对象面向全球,完成众多国外客户的订单;
(4) 价格低廉,接近成本价;
(5) 可以进行具有复杂结构基因(高GC含量、重复结构等)的合成;
(6) 忠实执行保密合同,为客户负责。


2 其他相关服务

2-1 基因定点突变:

A. 服务内容
在很多情况下,您获得的基因序列可能并不是您需要的最终序列,或许在某些地方有部分碱基不符合您的实验要求。比如有部分多余的碱基,或者丢失了部分碱基,或者个别碱基有突变,这些我们姑且都认为它是基因突变。那么要得到最终符合要求的序列,便需要对其进行修改。我们总称为基因突变服务。我们可根据您的任何需要对错误的序列做任何修改,以达到您的最终要求。
 
B. 服务说明
您须提供材料:含待变基因的质粒一份,量不少于1.0 ug;待变基因原始序列文件及原始测列图谱文件各一份;待变基因及其载体质粒的生物特性,如是否影响细菌增殖等。


C.收费标准

 
1-2个突变点
长度(bp)
1-999
1000-1499
1500-2499
2500-3999
4000以上
价格(元)
500
800
1200
2000
询价
周期(工作日)
7
7
10
15
\

 

·           以上突变每增加一个突变点增加200元费用
·           克隆到指定载体增加500元亚克隆费用
·           以上价格只针对正常序列


D.提供结果

实验报告、测序彩色波形图、测序方向图、序列碱基图、含有目的基因的质粒及甘油菌(或PCR产物)。
 
2-2目的基因的获取及其克隆

A.服务内容
● 基因组DNA的提取/总RNA提取
● 以基因组DNA或cDNA为模板PCR扩增得到目的基因
● 目的基因PCR产物的纯化及测序
● 目的基因的克隆及测序
● 目的基因亚克隆至表达载体中
 
B.服务说明
1. 我们目前接收的样品形式为与参考序列物种一致的材料、上述材料的基因组DNA或cDNA
1) 实验材料必须保证新鲜,请您采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。
2) 基因组DNA无明显降解,总量大于5? ug。如果基因丰度较低或调取的基因较长,请您提供尽量多的材料。
2. 由于材料的个体差异及PCR过程中会产生突变等原因,我们不保证获取的基因与参考序列的碱基完全一致
 
C.收费标准

 

服务内容
收费标准
实验周期
基因组DNA提取/总RNA提取
260-900元/样品
3个工作日
目的基因获取后PCR产物纯化、测序
询价
10个工作日
目的基因获取后克隆、测序
询价
15个工作日
目的基因亚克隆至表达载体
800-1500元/样品
5个工作日

 

以上实验周期是针对正常实验样品制定的,样品特殊或样品多时除外。
 
D.提供结果
实验报告、测序彩色波形图、测序方向图、序列碱基图、含有目的基因的质粒及甘油菌(或PCR产物)。

2-3 密码子优化和基因设计服务

A.服务内容
遗传密码有64种,但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons),那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌,酵母,哺乳动物细胞,Pichia,植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。有趣的是,灵长类和酵母有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此,重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响(尤其在异源表达系统中)的事实并不很奇怪。你的基因利用的密码子可能不是你正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子,这种情况是可能的。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子可以合成基因,基因的这种重新设计叫密码子最佳化。
 
B.服务说明
1.您须提供受体生物或细胞的详细信息
2.您须提供氨基酸序列。当不能够提供氨基酸序列时,则应提供DNA序列,并说明起始密码和终止密码的位置。
3.若有特别要求时,须附加说明。
4.我们的专业人员将根据您提供的信息进行密码子优化或者基因设计。设计完成后,将交付您进行审查。
 
C.收费标准
每100bp 75元人民币。对基因的序列有特殊要求的,费用将适当增加。如设计的基因在我公司合成则可以免收优化或设计服务,如条款C1.1所述。
 
2-4 质粒提取服务

A.服务内容

1. 普通质粒提取
根据您的需要,可一次性提取10-500 ug的质粒。提取后的质粒基本不含蛋白质、基因组DNA及Total RNA污染,带型清晰标准,可满足PCR扩增、测序、限制酶酶切、转化等常规实验的需要。

2. 超纯质粒提取
超纯质粒在提取过程中使用了一种特殊洗液,可大大减少内毒素的污染。经无内毒素水平检测,内毒素含量比普通质粒减少了60%以上。提取后的质粒能够用于转染,且费用低于无内毒素质粒提取。

3. 无内毒素质粒提取
革兰氏阴性细菌由于自溶或其他原因被破坏而从其细胞壁上释放出的毒性脂多糖称内毒素,它是影响细胞转染效率的重要因素,无内毒素质粒是获得高质量转染实验所必备的。
 
B.服务说明

1. 如果您提供的样品为质粒,请保证质粒的量≥100 ng,以满足琼脂糖凝胶电泳检测及转化需要;如果您提供甘油或穿刺保存菌种,请确保菌体活力较高,或将重新活化后的菌种寄给我们。

2. 我们首先对您提供的样品进行小量培养提取预实验,以鉴定质粒的正确性(与您提供的背景资料相符)及拷贝数(2ml培养提取量<1.5ug为低拷)。

3. 如果质粒为非氨卞青霉素、卡那霉素和氯霉素抗性时,请您提供抗生素及抗生素工作浓度。

4. 收费标准是针对高拷贝质粒制定的,低拷贝质粒请询价。

5. 如果需要进行PCR或测序检测,请提供PCR引物或测序引物,或您提供引物序列,由本公司合成。引物合成、测序等费用,需额外收取。

6. 进行无内毒素质粒提取后我们通常不进行内毒素含量检测。由于提取质粒的所有步骤均按照试剂盒的标准流程进行,因此提取的质粒内毒素含量小于100 E.U./mg。

C. 收费标准

服务内容
提取量
收费标准
交货期限
普通质粒提取
10ug
50元/样品
3个工作日
50ug
150元/样品
6个工作日
100ug
250元/样品
超纯质粒提取
50ug
300元/样品
100ug
500元/样品
无内毒素质粒提取
100ug
800元/样品
200ug
1500元/样品

 

D.提供结果

实验报告(包括质粒电泳照片及OD值测定结果)、1.7≤OD260/280≤2.0的质粒、甘油菌及穿刺菌。


 

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DNA 合成及随机引物


DNA合成

1. 上海生工是世界上最大的化学合成DNA专业公司之一,实力雄厚。现有二十多台高通量
        DNA合成仪,日产引物达10000条。

2. 完善的销售网络,在全国拥有30多处办事处和10多个代理公司,在全球设有40多个国际
        代理商。

3. 拥有世界范围的市场,合成的引物大量销往美国、加拿大、欧洲、日本以及东南亚地
        区。

4. 在北京设有DNA合成分部,使北京的用户可以更快的拿到产品。

5. 严格的质量控制,基本合成级DNA和修饰DNA全部采用质谱与电泳双重QC,2003起每
        年通过ISO 9001国际质量体系认证。

6. 市场占有率高,占有全国DNA化学合成市场的70%以上。

7. 品种齐全,除各类修饰碱基、普通引物外,还有HPLC、PAGE和HAP纯化以及SiRNA 合
        成。


<1. 基本合成>
 (“基本合成”的每一条DNA产品都经过电泳和质谱双重检测,并免费提供质谱检测图谱)

对应DNA长度 纯化方法 碱基单价
合成产量
2 OD  5 OD 10 OD
10~39 ULTRA HAP ¥1.60/bp ¥2.00/bp ¥2.50/bp
10~59 ULTRA PAGE ¥1.80/bp ¥2.50/bp ¥3.20/bp
60~89 ULTRA PAGE ¥4.00/bp ¥5.00/bp ¥8.00/bp
5~89 HPLC* ¥80.00元/纯化 ¥100.00元/纯化 ¥160.0元/纯化

*HPLC纯化产品的碱基单价请参照ULTRA PAGE的碱基单价

不同纯化方法的应用:

产品用途 纯化方法

图例: 
/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA合成/DNAhecheng01.png

ULTRA HAP ULTRA PAGE HPLC
普通PCR  
多重PCR或定量PCR  
点突变或克隆  
基因合成    
反义DNA    
修饰或标记DNA  
RNA干扰    
化学或物理应用    

“√”表示推荐的纯化方法, “”表示部分适用

<2. 快速合成> (“快速合成”的每一条DNA产品都经过电泳检测)

对应DNA长度 纯化方法 碱基单价
合成产量
2 OD  5 OD 10 OD
10~39 HAP ¥1.60/bp ¥2.00/bp ¥2.50/bp
10~39 PAGE ¥1.80/bp ¥2.50/bp ¥3.20/bp
40~59 PAGE ¥1.80/bp N/A N/A

<3. 反义DNA合成>

产品名 合成产量
2 OD 5 OD 10 OD 20 OD
硫代碱基 ¥5.00 ¥5.00 ¥6.00 ¥8.00
DNA碱基 ¥1.80 ¥2.50 ¥3.20 ¥5.00
2F-RNA ¥250.00 ¥350.00 ¥500.00 ¥800.00
2’-O-Methyl碱基 ¥80.00 ¥100.00 ¥160.00 ¥240.00
5-Methyl dC ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00 ¥800.00
5’FITC(6-FAM) ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00 ¥800.00
HPLC纯化* 80元/纯化 100元/纯化 160元/纯化 240元/纯化

*生工建议反义DNA最好选用HPLC纯化,这样可以加强反义DNA的表现性能和降低产品中的盐份。 ** 反义DNA中如含有2F-RNA或5’FITC标记或5-Methyl dC,则免收HPLC纯化费

硫代碱基                      2’-O-Methyl碱基                  5-Methyl d 
  http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng02.png          http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng04.png              http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng03.png 
      
FITC                               FITC吸收&发射波谱 
 http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng06.png       http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng07.png

 
<4. 长链DNA合成>

对应DNA长度 合成产量 碱基单价
90~105 1~2 OD ¥6.00/bp


<5. 短链DNA合成>

对应DNA长度 合成产量 单价
5~9 2 OD ¥16.00/条
5~9 5 OD ¥24.00/条
5~9 10 OD ¥36.00/条
5~9 20 OD ¥60.00/条


<6. 碱基修饰DNA> 
(以下修饰DNA产品按实际情况选择纯化方式)

产品名 合成产量
2 OD 5 OD 10 OD
dI (脱氧次黄嘌呤) ¥80.00 ¥100.00 ¥160.00
dU (脱氧尿嘧啶) ¥120.00 ¥150.00 ¥240.00
2-Aminopurine ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00
5-Bromo dU ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00
3’Inverted dT ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00
3’ddC ¥500.00 ¥600.00 ¥900.00


           dI                      dU                2-Aminopurine       5-Bromo dU 
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng09.png    http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng10.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng11.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng12.png

3’Inverted dT              3’ddC                             
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng13.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng14.png           
 

<7. BIOTIN修饰DNA> (所有BIOTIN修饰DNA全用HPLC纯化)

产品名 合成产量
2 OD 5 OD 10 OD
5’Biotin ¥200.00 ¥250.00 ¥350.00
3’Biotin ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00
中间Biotin dT ¥600.00 ¥750.00 ¥1,150.00
5’PC Biotin ¥1,500.00 N/A N/A
5’Dual Biotin ¥2,000.00 N/A N/A


             5’Biotin                              3’Biotin                        中间Biotin dT   
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng15.png     http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng16.png     http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng17.png 
        5’PC Biotin                         5’Dual Biotin 
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng18.png       http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng19.png

<8. Spacer修饰DNA> (以下修饰DNA产品按实际情况选择纯化方式)

产品名 合成产量
2 OD 5 OD 10 OD
C3 Spacer ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00
Spacer 9 ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00
3’C6 Spacer ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00
Spacer 18 ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00
dSpacer ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00
PC Spacer ¥1,500.00 N/A N/A

C3 Spacer                 Spacer 9               3’C6 Spacer         Spacer 18  
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng20.png        http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng21.png        http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng22.png        http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng23.png  
dSpacer                   PC Spacer                      
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng24.png        http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng25.png         

<9. NH2及SH修饰DNA> 
(所有NH2及SH修饰DNA产品全用HPLC纯化)

产品名 合成产量
2 OD 5 OD 10 OD
5’NH2 C6 ¥150.00 ¥200.00 ¥300.00
3’NH2 C6 ¥250.00 ¥350.00 ¥500.00
5’NH2 C12 ¥500.00 ¥600.00 ¥800.00
中间NH2 C6 dT ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00
Uni-Link NH2 ¥750.00 ¥750.00 ¥950.00
5’SH C6 ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00

3’SH C3

¥400.00 ¥500.00 ¥800.00

Dual SH

¥800.00 ¥1000.00 ¥1500.00


5’NH2 C6              3’NH2 C6              5’NH2 C12      中间NH2 C6 dT  
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng26.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng27.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng28.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng29.png  
Uni-Link NH2             5’SH C6            3’SH C3                Dual SH 
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng30.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng31.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng32.png      http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng33.png


<10. Dark Quenchers> 
(所有Dark Quenchers DNA全用HPLC纯化)

产品名 合成产量 最大吸收波长 (nm)
2 OD 5 OD 10 OD
3’BHQ -1 ¥500.00 ¥600.00 ¥800.00 534
3’BHQ -2 ¥500.00 ¥600.00 ¥800.00 578
3’Dabcyl ¥500.00 ¥600.00 ¥800.00 478
5’Dabcyl ¥500.00 ¥600.00 ¥800.00 478
3’Eclipse ¥500.00 ¥600.00 ¥800.00 522


<11. 其它修饰DNA> 
(以下修饰DNA产品按实际情况选择纯化方式)

产品名 合成产量
2 OD 5 OD 10 OD
5’磷酸化 ¥200.00 ¥250.00 ¥350.00
3’磷酸化 ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00
5’地高辛 ¥500.00 ¥700.00 ¥1000.00
3’地高辛 ¥600.00 ¥800.00 ¥1200.00
5’CHCH(炔基) ¥500.00 ¥600.00 ¥800.00
5’CHO(醛基) ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00
5’COOH(羧基) ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00
5’Acrydite ¥800.00 ¥1000.00 ¥1500.00
5-Nitroindole ¥1500.00 N/A N/A
3’Cholesteryl ¥1500.00 N/A N/A


     5’磷酸化                3’磷酸化                   5-Nitroindole              地高辛         
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng34.png       http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng35.png       http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng36.png       http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng37.png  
             
5’Acrydite            3’Cholesteryl             5’炔基                       5’醛基                 5’羧基 
http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng38.png    http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng39.png    http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNA%E5%90%88%E6%88%90---A1.-DNA-%E5%90%88%E6%88%90%EF%BC%881%EF%BC%89(1).png    http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng41.png    http://www.sangon.com/admin/fckeditor/editor/filemanager/connectors/userfiles/image/DNA%E5%90%88%E6%88%90/DNAhecheng42.png


<12. 分子信标> 
(所有分子信标DNA全用HPLC纯化)

产品名 合成产量
荧光基团 淬灭基团 2 OD 5 OD 10 OD
5’6-FAM 3’Dabcyl ¥1000.00 ¥1200.00 ¥1800.00
5’TET 3’Dabcyl ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
5’HEX 3’Dabcyl ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
5’TAMRA 3’Dabcyl ¥900.00 ¥1200.00 ¥1800.00
5’CY5 3’Dabcyl ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00


<13. 荧光标记DNA> 
(所有荧光标记DNA全用HPLC纯化)

产品名 合成产量 吸收&发射波长(nm)
2 OD 5 OD 10 OD
5’6-FAM ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00 495&520
中间6-FAM-dT ¥700.00 ¥850.00 ¥1,300.00 495&520
3’6-FAM ¥300.00 ¥350.00 ¥500.00 495&520
5’TET ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00 522&539
5’HEX ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00 538&555
5’TAMRA ¥400.00 ¥500.00 ¥800.00 559&583
3’TAMRA ¥500.00 ¥600.00 ¥900.00 559&583
中间TAMRA-dT ¥800.00 ¥1,000.00 ¥1,600.00 559&583
5’ROX ¥500.00 ¥600.00 ¥900.00 588&608
3’ROX ¥600.00 ¥700.00 ¥1,000.00 588&608
5’Texas Red ¥500.00 ¥600.00 ¥900.00 588&608
5’ Cy3 ¥800.00 ¥1,500.00 ¥2,500.00 550&564
中间Cy3 ¥800.00 ¥1,500.00 ¥2,500.00 550&564
3’Cy3 ¥900.00 ¥1,700.00 ¥2,800.00 550&564
3’Cy5 ¥900.00 ¥1,700.00 ¥2,800.00 550&564
5’Cy5 ¥800.00 ¥1,500.00 ¥2,500.00 648&668
5’Cy5.5 ¥1,950.00 N/A N/A 685&706
5’AMCA ¥500.00 ¥600.00 ¥900.00 353&442
3’AMCA ¥600.00 ¥700.00 ¥1,000.00 353&442
5’JOE ¥500.00 ¥600.00 ¥900.00 529&555
3’JOE ¥600.00 ¥700.00 ¥1,000.00 529&555
Alexa Fluor 488 ¥1000.00 N/A N/A 492&517
5’Methylene Blue ¥800.00 ¥1,500.00 ¥2,500.00  
3’Methylene Blue        


<14. 双标记DNA探针> 
(所有双标记DNA探针全用HPLC纯化)

产品名 合成产量
荧光基团 淬灭基团 2 OD 5 OD 10 OD
5’6-FAM 3’TAMRA ¥1000.00 ¥1200.00 ¥1800.00
3’BHQ-1 ¥1000.00 ¥1200.00 ¥1800.00
中间 BHQ-1 dT ¥1500.00 ¥2000.00 ¥2500.00
3’Eclipse ¥1000.00 ¥1200.00 ¥1800.00
5’TET 3’TAMRA ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
3’BHQ-2 ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
5’HEX 3’TAMRA ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
3’BHQ-1 ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
3’BHQ-2 ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
中间 BHQ-1 dT ¥1700.00 ¥2200.00 ¥2700.00
5’TAMRA 3’Eclipse ¥900.00 ¥1200.00 ¥1800.00
3’BHQ-2 ¥900.00 ¥1200.00 ¥1800.00
5’ROX 3’Eclipse ¥900.00 ¥1200.00 ¥1800.00
3’BHQ-2 ¥900.00 ¥1200.00 ¥1800.00
5’CY5 3’BHQ-2 ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
5’CY3 3’BHQ-2 ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
5’JOE 3’BHQ-2 ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00
5’Texas Red 3’BHQ-2 ¥1200.00 ¥1400.00 ¥2000.00



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苏木紫液用法

     
     实验室常用的苏木紫液有多种,以下为有代表性的数种,可根据各单位具体情况选用。

1.哈里新(Harris)苏木紫液

甲液:苏木紫Ig,无水乙醇10ml。乙液:硫酸铝钾(或铵)20g,蒸馏水200ml,加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合,加热煮佛,沸后去火,待溶液不翻腾时即加入氧化汞0.5g(此时有大量气泡生成,故容器宜大,以免液体溢出)。然后染液迅速冷却,冷却后过滤,即可位应用。用时每100ml加冰醋酸4ml;

2.迈尔(Mayer)苏木紫液

将苏木柴0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解,再加入硫酸铝钾5g,和碘酸钠0.02g,搅动直到全部溶解,加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g,加煮沸5min,冷却、过滤,放置过夜,即可应用。染色时间约10~20min;

3.欧立区(Ehrlich)苏木紫

将苏木紫2g溶于无水乙醇100ml中;将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml中,加入甘油100ml,将二液混合,最后加入冰醋酸10ml,充分混匀后,盛于无色小口瓶内,暴露于日光下,使其自然成熟,约需3个月。染色时间约5~20min。此液贮存愈久,染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg,使人工成熟,配成后即可应用;

4.卡拉兹(Carrazzi)苏木紫

将苏木紫0.5g溶解于甘油100ml中,将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水350ml中溶解后将二液慢慢混合,并充分摇匀。将碘化钾0.1g放于蒸馏水50ml中,加微温溶解,然后加入苏木紫液中,充分摇匀,翌日可用。

【 伊红液配制 】

     伊红1g,蒸馏水5ml。溶解后滴冰醋酸于期中,有沉淀生成,至成浆糊状再加入水数毫升,并继续滴冰醋酸,直至沉不再增加,过滤,弃滤液留沉淀物,待其干燥后,溶于95%乙醇200ml即成。

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考马斯亮蓝G-250与R-250的区别


考马斯亮蓝G-250与R-250的区别

       考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue R-250)为三苯基甲烷(triphenylmethane),每个分子含有两个SO3-H基团,本身偏酸性,磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料-蛋白质复合物。MW=824,λmax=560-590nm。 考马斯亮蓝有G250和R250两种,在颜色索(Colour Index)中给出了不同的编号(42655和42660)。亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶,在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两种染料均能对固定的蛋白进行有效地染色,使用浓度为溶于甲醇:冰醋酸:水(50:10:40)的0.05%溶液。考马斯亮蓝G250与蛋白质的结合反应十分迅速,是常用的蛋白染料,染色后为蓝绿色,常用来作为蛋白质含量的定量测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质结合虽然比较缓慢,但是燃料可以穿透凝胶,染胶效果好,染色后为红蓝色,且可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。G250也可染胶,但染色过程慢且染色后背景高,脱色困难。考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色,染色灵敏度比氨基黑高5倍。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内(15-20g),扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意这点。 

    考马斯亮蓝G250(Coomassie brilliant blue G-250)为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue),是一种甲基取代的三苯基甲烷。比考马斯亮蓝R250多二个甲基,MW=854;λmax=590-610nm,游离状态下呈红色。染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。其优点在于它在三氯乙酸中不溶而以胶体形式存在,能选择性地和蛋白质形成复合物,染色迅速,着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来,约45分钟后着色最深,本底低,重复性好,适用于定量分析。

    考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1,000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。